Топфейс котлас: Знакомства с девушками в городе Котлас

Содержание

Meet girls in Kotlas | Dating site

Topface——Kotlas的免费交友网。数千的女人会很高兴能认识到你：积极一点、送情意、说恭维话、请约会！

Olga, 32
Я ищу парня, 31-37
Светлана, 45
Поговорим — молчала она. Не кричи — устало уходил он. Не до тебя — шептала Вселенная…
Ирина, 43
На VlP не отвечаю.

Ирина, 45
Хочу жить в большом своем доме.Будем вместе строить?
Галина, 54
Мне инересны люди с которыми можно поговорить:)
история
мой сын
+更多5

Алена, 38
У меня пока нет статуса. Напишите, что думаете обо мне.
Нонна, 47
занятые,женатые,с мест лишения-не пишите,спасибо.
нина, 69
Хочу встретиться
Люблю Жизнь!!
Всё что интересно
Общение с интересными людьми,
+更多6
Светлана, 45
У меня их много
хочу любить и быть любимой!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
vkontakte.ru
Татьяна, 47
—
Москва слезам не верит
КВН
От заката до рассвета
+更多3

Леночка, 44
У меня пока нет статуса. Напишите, что думаете обо мне.
Людмила, 47
работа и карьера
МНЕ ВСЁ ОЧЕНЬ ИНТЕРЕСНО
+更多2
ЕЛЕН, 48
Мужчину чтоб за каменной стеной
Жизнь прекрасна
+更多1
Екатерина, 41
Я не фотомодель. Я просто женщина
комедии
Люблю Жизнь!!
Шансон
+更多3
Натали, 47
..утоли мои печали
В личке все написано…
+更多1

Игорь Пышкин, Котлас, Россия, ВКонтакте, id144893562

Шпильки | Женский Журнал
С нами вы узнаете о всех секретах женской красоты, а также о: ⭐Лучших идеях макияжа, маникюра и причесок ⭐Самых последних новинках моды ⭐Трендах ⭐Уходе за волосами, лицом и телом ⭐Новостях любимых звезд ⭐Историях из жизни женщин и многое другое! Рады вас видеть, будет интересно!

LIVE
Крупнейший источник новостей о ВКонтакте в видимой Вселенной

Редкие кадры — юмор, приколы, картинки

Котлас Онлайн
Если у вас есть свежие новости о Котласе, фотографии проблемных мест города, темы для обсуждения — предлагайте на стену! ————— В вашем детском саду или школе прошло интересное мероприятие? Расскажите об этом всему Котласу! ————— У вас есть претензии к магазину или управляющей компании? Чиновники не хотят работать? Опишите ситуацию в «Предложить новость»! ————-— Нашли чужие ключи, карту или что-нибудь еще и хотите вернуть владельцу — предлагайте на стену! Если потеряли — тоже предлагайте! —————- Можно бесплатно почитать нашу газету на телефоне — http://m.kotlas-info.ru/newspapers/vkmobile/list Правила группы — https://vk.com/topic-27069463_32585310 Прием объявлений в газету — http://kotlas-info.ru/adspaid.html Подписка на газету — http://kotlas-info.ru/svk-address Мы в Инстаграм — www.instagram.com/kotlas_online/

Новости из прошлого
Наши корреспонденты работают не только во всех уголках планеты, но и перемещаются во времени, чтобы донести до вас малоизвестные факты из прошлого.

Настоящий Оптимист
Много позитива! Мы оптимисты по жизни!

Любовный гороскоп | Эзотерика
Любовный гороскоп на каждый день. Самый точный прогноз любовного гороскопа ♥

Думай и Богатей
Великие мысли — Великих Людей! Цитаты — Афоризмы, полезные советы))) Лучшие фильмы…

Львы • 2021
Лев — великодушен и не дурак сам над собой посмеяться. Всем остальным от насмешек над Львом стоит воздержаться.

* ПРОВИНЦИАЛКА * стихи
❖ ════ ❖🍂❖❖ ❄ ❖ ❄ ❖ ❄ 🍂 ❖ ═════ ❖ Создана для людей, которые любят жить и радоваться каждому дню, независимо от места проживания.

Мультиварка (рецепты в мультиварке с фото)
сборник лучших рецептов для мультиварки

Школа Выживания | Выживание

Эзотерика. Саморазвитие. Путь к себе

Секреты здоровья. О чем молчат врачи.
Как бюджетно и своими силами оставаться здоровыми долгие годы. То, о чем вы не услышите в поликлинике… Вместе ищем неизвестные, забытые и замалчиваемые методы поддержания молодости, красоты и здоровья. Не забывайте, что панацея еще не изобретена, так что только методом проверки на себе можно понять работает тот или иной совет конкретно для вас. Эксперименты и здравый смысл, а так же любопытство и непредвзятость вам в помощь!

Секреты счастливых отношений
Группа для тех, кто хочет мечтать, сотворить, играть и любить. МЕНЮ ГРУППЫ https://vk.com/page-56136839_44652327

КРУТЫЕ ПРИКОЛЫ
Подборки весёлых авторских самых смешных анекдотов, историй и видеоприколов

Гороскоп. Лев
Самый актуальный гороскоп для Львов. Присоединяйтесь!

Секс знакомства для интима в котласе

Пикантные встречи на высшем уровне! Девчонки, кто сделает Куни хорошему парню? Семейная пара мж познакомиться для группового секса с щедрым мужчиной Знакомства для минета кунилингус Секс онлайн знакомства прямо сейчас. Знакомства в минусински Пасс 28лет Знакомства на опера мини Спонсор Администратором сети апартаментов Москва Праситутки спб сеном плошеде.

Легкие или серьёзные знакомства Архангельской области.
Секс знакомства для интима г. Котлас — тысячи людей ищут секс на сайте для взрослых SexBook.
знакомство на одноклассниках Кропоткин.

Познакомлюсь с девушкой для встреч!! Никаких обязательств пишите в лс!. Mitya Savenkov pinned post 15 Apr at pm. Девушки секаса ну очень не хватает, помогите. Dmitry Dmitrich pinned post 15 Apr at pm. Два парня ищут двух девушек завтра на ночь,поляна и вознаграждение гарантируем. Sialis Levitrov pinned post 15 Apr at pm. Alexander Kiselev pinned post 15 Apr at pm. Ищу постоянную местную любовницу,возраст лет,для постоянных встреч. Пишите мне в личку. Kuni Kuni pinned post 15 Apr at pm. Дам номер девушки час коряжма.

Секс знакомства Котлас pinned post 15 Oct Ulyana Turisova. Dmitry Poroshin.

ПРЕДЛОЖИЛ СЕКС 500 ДЕВУШКАМ В БАДУ, ТИНДЕР, ТОПФЕЙС. КАК НАЙТИ СЕКС БЫСТРО. СОЦИАЛЬНЫЙ ЭКСПЕРИМЕНТ

Давно пора, где вы были раньше? Геев туда же!. Секс — это немаловажная составляющая жизни, и в случае если у вас не имеется постоянного партнера, это не значит, что надо отказаться от секса. Этот портал предлагает вам найти мужчину для короткого свидания, основная цель которого — ваш оргазм. Тут вы найдете большой выбор представителей сильного пола и сумеете подобрать такого, кто принесет вам неповторимое удовлетворение.

Мужчины для секса уже ожидают вашего звонка, решайте, кто вам больше всех понравился! Я парень, чистоплотный, не толстый, люблю лизать женские дырочки, могу встретиться с парой, не…. Ищу двух оторванных и весёлых подруг для регулярного интима. Просто приятное времяпрепровождение. Заинтересованные — пишите. Без интимной составляющей жизнь никогда не будет наполненной смыслом, и это понимают все представители сильного пола.

Если не имеется сексуальных связей, не делается работа, не выходит ничего в быту и всегда плохое настроение. Но мы знаем, как поспособствовать вам в этом случае. На нашем ресурсе каждый сможет снять девушку для секса и добавить яркость в скучные будни.

Если вам наскучил однообразный секс с женой, мы предлагаем снять проститутку! Это будет наиболее грамотное решение, ведь так вы сможете сбросить негатив и возвратиться домой с отличным настроением. Ну а если вы холостяк, значит секс знакомства В Котласе как раз предназначены для вас. Красивейшие девушки округи выложили свои снимки и ожидают вашего вызова. Завести секс знакомства без обязательств будет приятно каждому самцу. Эта партнерша воплотит каждую вашу идею в кровати и не будет требовать продолжения свидания.

Знакомства с богатыми женщинами минск для секса Девочка по вызову котлас

Вы можете просто испытать наслаждение и забыть о ней. Красотки предлагают не один половой акт, но и дополнительные услуги: массаж, стриптиз, лесби шоу. Можно заказать сразу двух красоток, если ваша мечта — секс втроем. Секс знакомства без регистрации — это очень удобно, предлагаем вам убедиться в этом лично при помощи этого ресурса! Вызывайте проституток, не выходя из дома: они самостоятельно приедут к вам, куда скажете, и ублажат, как прикажете. Отдохните и отдайтесь эмоциям: девушки сами знают, каким образом доставить вам неземное удовольствие! Секс знакомства для интима в котласе Сейчас на сайте знакомств для взрослых объявлений.

Пожаловаться Ищу мужчину Ищу девушку Ищу жигало Ищу проститутку. Девушка, с удовольствием познакомлю Жду в гости. Посмотреть 26 лет Пошалю в скайпе!

Знакомства для секса в Котласе

Евгения35 Cherkasy. Хочу сделать подарок мужу на день рождение, поэтому ищу раскрепащенную девчулю от 23 до 27 года с упругой Молоденькая страстная и очень сексуальная девушка ждет именно Вас для осуществления Ваших самых заветных… Посмотреть 24 года Соня 21 год, Котлас. Интимные секреты женского счастья Секс в жизни женщины играет роль не менее важную, чем для мужчины. Всё строго…. Если вы не из города Котласа, то вы можете выбрать свой город и начать бесплатно знакомиться с земляками и землячками, которых здесь зарегистрировано очень много. Mitya Девушки ищут секс Котлас pinned post 15 Apr at pm. Симпатичная пара, ухоженная, аккуратная, Ж — блондинка, синие глаза, плотного телосложения, роствес 80, Тогда у представителей сильного пола не возникнет мысли убегать от семейных обязанностей. Народ, как дела? Привет, давно хотел познакомиться с кем-нибудь, хотел бы секс на одну ночь или просто обмен интим фото, буду Это будет наиболее грамотное решение, ведь так вы девушки ищут секс Котлас сбросить негатив и возвратиться домой с отличным настроением. Девчонки, кто сделает Куни хорошему парню?

Я Алена Вк не отвечаю!!!. Alexander Petrov pinned post 11 Apr at pm. Есть, реальные без предоплаты?

Навигация по записям

Artur Kiselev pinned post 11 Apr at pm. Кто сделает миньет лайкайте. Sasha Petrov pinned post 9 Apr at am.

Котлас кто сделает молодому парню мине в машине за мп. Elena Berezina. Кругом одни пидорасты!. Andrey Bolshoy.

Секс знакомства Котлас

Content

Знакомства Котлас

Или заполните короткую форму

Girls from your city Kotlas, Arkhangelskaya

Знакомства Котлас, Россия

Анюта Kiss г. Машуля г. Ксюша г. Масюня г. Артем г. Антонио г. Мария г. Оксана г.

Знакомства Котлас

Найди новых друзей в городе Котлас уже сегодня! Знакомства без регистрации для серьезных отношений и создания семьи. Знакомства Котлас онлайн | Знакомства Котлас без регистрации бесплатно (Архангельская область) | Сайт знакомств Котлас –

Дарья г. Олеська г. Анастасия г. Алексей г. EVA г. Ирина г. Даша г. Login to LovePlanet. Login Forgot your password? Script execution is disabled in your browser. Website might work incorrectly.

Или заполните короткую форму

Your cookies are disabled. Our website will not work correctly. Use the search at the top of the form or search here. Ищу женщину лет для секса без обязательств. Можно немного полненькую. Желательно с местом квартира или Парень 18 лет хочет найти девушку в Котласе. Привет, давно хотел познакомиться с кем-нибудь, хотел бы секс на одну ночь или просто обмен интим фото, буду Ищу пассивного кроссдрессера.

Dating in Kotlas | Dating site | Topface.
Online Dating in Kotlas, Arkhangelskaya.
секс знакомства Нефтекамск девушки.
Другие города региона Архангельская область.
Сайт знакомств в Котласе (мужчины)?

Ищу полностью пассивного кросса для секса. О себе: 21 год, рост , вес Член Возможно и Мужчина ищет пару из Котласа для секса.

Girls from your city Kotlas, Arkhangelskaya

Мне 33 года, в поисках новых ощущений, а именно ищу пару для встреч, в возрастете от 20 до Девушка 23 года хочет найти мужчину для орального секса в г Очаровательная и нежная особа встретиться с чистоплотным и приятным мужчиной на авто, для его орального Женщина 43 года хочет найти мужчину в г. Свободная женщина 43 года, ищет мужчину для отношений, но не замужества. Интересного, обеспеченного с Красивая девушка 24 года хочет найти мужчину для секса в г Познакомлюсь с чистоплотным мужчиной, для интим отдыха.

Я молодая, красивая девушка с большой грудью.

Женщина 39 лет хочет найти мужчину для секса в г. Познакомлюсь с мужчиной от 35 лет би или гетеро сексуалом любителем куни, фистинг и не только. Девушка 28 лет хочет найти мужчину для секса в г.

Включите javascript в настройках вашего браузера. Россия, Архангельская область, Котлас, мужчины и женщины, только с фото. Сбросить параметры поиска.

Знакомства Котлас, Россия

Лучшее место для знакомства на одну ночь, неделю, месяц, год и на всю жизнь! С высокими. Олеська г. Здравствуйте,ищу девушку проходила в районе городской больницы ,была одета, в бордовое пальто,примерно в 9. Бесплатный сайт знакомств знакомство на Котлас регистрации. Выбирай, каким будет твой город! ГородаМеняютсяДляНас Котлас. Nikolay Martynov. Dm, 46 лет, хочет познакомиться Dm. Выберите страну. Блин как я жалею We use cookies to improve user navigation and collect site attendance information.

Поделиться ссылкой в социальных сетях:. Сергей , 51 год Котлас, Россия 2 фото. Ольга , 56 лет Котлас, Россия 7 фото.

Знакомства Котлас, бесплатный сайт знакомств без регистрации.
Создайте свою учетную запись в один клик.
Сайт знакомств Котлас, бесплатные знакомства без регистрации.
Ищу тебя Котлас.
Знакомства в Котласе, частные объявления с фото на ;

Павел , 64 года Котлас, Россия. Алексей , 31 год Котлас, Россия 2 фото. Наталья , 66 лет Холмогоры, Россия 1 фото.

Знакомства с девушками в городе Калинин

Topface сайт знакомств с иностранцами

Удобство сайта — 7,1. Количество пользователей — 7,7. Уровень хамства — 1,7. Наличие ботов — 3,3. Cервисы для знакомств — 6,9. Уровень техподдержки — 7,1. Перейти на TopFace. Перейти на JuliaDates.

О сайте знакомств Топфейс На Топфейс собраны анкеты людей со всего мира. Регистрация на сайте На сайте Topface бесплатная онлайн регистрация. Бесплатные функции. Просмотр симпатий и гостей страницы, при этом указывается, из какого города пользователь. Функция невидимки работает только при оформлении Премиума. Она дает возможность без оповещений заходить к другим;. Если слишком часто переходить со страницы на страницу, то можно увидеть навязчивое уведомление об этом;.

Перейти на официальный сайт. Наш вердикт На сайте собраны пользователи из разных стран мира. Регистрироваться однозначно стоит! Зарегистрироваться бесплатно. Подбор сайта знакомств Я ищу Муж Жен. Цель знакомства Серьезные отношения Флирт Общение.

Знакомства с девушками в городе Котлас

Подобрать сайт. Отзывы о сайте знакомств TopFace Все отзывы Положительные отзывы Отрицательные отзывы 1. Техподдержкой ни разу не пользовался. Полезен ли отзыв? Еще отзывы. JuliaDates 9,8. Знакомства для успешных мужчин и амбициозных девушек. Найди отношения на своих условиях! Для того, чтобы написать свою — еще увлекательнее! Если вы тоже однажды покупали или продавали что-то на Авито, расскажите об этом нам.

Мы принимаем ваши истории в специальной форме. И в течение двух-трех дней опубликуем их на странице проекта , чтобы все могли прочитать. Авторы трех самых интересных историй, присланных пользователями, получат классные призы — iPhone XR с красивым пикабушным чехлом. Победителей определит наше жюри. Отправить свою историю на конкурс. Поиск Теги. Но без тегов. Тип постов. Период времени. Топфейс Девушки Беременность Знакомства.

Хочу анонимно поделиться результатами моих экспериментов, мне интересно, наблюдал ли кто-то в жизни остро эти моменты. На протяжении месяца веду с него записи, обновляю фоточки, добавляю друзей, делаю для него фейковых родственников. Потом беру пару случайных красивых девушек, пишу им и предлагаю секс за деньги. Начинаю с 10 тысяч, потом предлагаю Из семи девушек ни одного отказа. Трое соглашаются сразу оговаривая условия типа минет в резинке , остальные просят время подумать или сперва встретиться и обговорить вживую боятся развода.

Какой делаем вывод?

Нет, девушки не меркантильные продажные твари, нет. Просто мне совершенно случайно попались такие.

topface.com

И тот факт, что из семи случайно выбранных девушек ни одна не отказалась, ни о чем не говорит. Через месяц приступаю к эксперименту и вбрасываю свою анкету в группу знакомств города. Отмечу, что я вбрасывал туда и личную страничку, но на нее так и никто не написал. В течение суток мне пишет 5 девушек, на вторые сутки еще 5, потом по в день, потом одна в день и далее по убывающей. Все согласны встретиться хоть сегодня, даже настаивают на этом, номер телефона дают без разговоров.

Topface (Топфейс) — Гавносайт знакомств [антиреклама]

Пробую писать им с личного аккаунта. Начинаются отмазки: Для чистоты эксперимента пишу случайным девушкам со своего аккаунта. Картина та же самая. Потом пишу этим же девушкам с фейка мачо, и ситуация резко меняется: Какой вывод? Да он напрашивается сам собой: Ставлю свое фото. Если честно, то общение совсем не идет. Вокруг одни скучные и неинтересные девушки, беседы вялые, отвечают через раз. Ставлю фото милого паренька. Ситуация резко меняется. Девушки начинают часто писать первыми, общение стало намного дружелюбнее и игривее, мне рассказывают всякие офигительные истории, зовут прогуляться.

Потом я убираю фото и ставлю просто картинку. Поток сообщений резко спадает. Однако одна девушка запомнила то фото и написала на этот аккаунт спустя пару дней. Сперва я был в шоке: Через некоторое время она спросила: И описала внешность того няшного паренька. Тут я все понял. Скинул ей свое фото, она написала «ясно» и постепенно слилась. Вывод такой же как и в прошлом эксперименте: Теперь понятно почему одним попадаются «хорошие» девушки, а другим — нет.

Это одни и те же девушки, просто перед симпатичными стелятся, а перед остальными показывают свое гнилое нутро. А еще я пробовал писать с фейков мачо знакомым понравившимся девушкам которые лично меня в друзья не добавили и не ответили ни на одно сообщение. Результат предсказуем: И после всего этого эти овцы жалуются, что никто не ценит их внутренний мир. И после всего этого эти овцы ноют, что парни их бросают после первого перепиха.

Так что вы хотели от красавчика, у которого таких как ты как говна? И как вы можете сметь требовать романтики, если красная цена вашей дырке — полторы тыщи час? Потом я пробовал создавать фейки девушек, но пришлось прикрыть эти акки, ибо в сутки писало и добавлялось по 10 парней, а меня тупо задалбывало общаться с таким количеством народу. Вот оно, равноправие. Всем привет! Привет подписчикам и подписчицам! Так что кому не интересно, просто не читайте Дело в том, что предыдущая история «О проститутках», ну та, который «с говнецом» — зашла у вас на «5». Отношение к девушкам.

Требования в отношениях.

Знакомства с девушками в городе Калинин

Если сказать коротко, то TopFace – это сайт знакомств. Если дать TopFace . Множество. платформ. Знакомства с. иностранцами. Простая. Все о сайте знакомств — советы по знакомству, описание платных функций, отзывы пользователей, знакомьтесь на

Я не терплю полумер. Я никогда не нахожусь в активном поиске. Честность и верность. Деньги в долг. Как-то так.

Сайт знакомств TopFace

Схема такая, включаем скайп, смотрим друг на друга, если все нравится то дальше уже общаемся, затем прилетаю, и забираю с собой. Всегда 15 минут общения заменят неделю переписки. Использовав всеми знакомый сервис для знакомств — Topface сайт знакомств с иностранцами, с помощью массовой рассылки, респонденток я решил провести опрос. На всех сайтах знакомств обман и развод, а ты хочешь построить серьезные отношения? Мы же договорились, значит и «до» и «после» есть планы, поэтому можно приехать за 10, 15 минут, которые нас не убьют. В цвет мы попали только со второго раза, но это совсем другая история. Кроме реальной жизни часто веду беседы на разных сайтах знакомств. Знакомьтесь с девушками везде, не бойтесь отказа, они сами хотят,чтобы с ними знакомились. Войти на сайт. Теперь понятно почему одним попадаются «хорошие» девушки, а другим — нет. Да, при каких-то обстоятельствахусловно, секс может случится вечеринка и т.

Не судите строго. Пару дней назад написала девушка Спустя некоторое время решила сама ответить на свой вопрос. На волне постов про сайты знакомств. Сразу скажу, что тут не будет трешовых историй. В Тиндере более серьезный люд, у девушек часто встретишь описание и цели на иностранном языке. Хотя еще есть вариант,что они это пишут,чтобы отсеить тех,кто не знает язык, типа чтобы найти более образованного парня. Однако,за долгое время,что я провел на многих сайтах, я понял,что их объединяет одно — парни, которые шлют фото своего члена и сразу приглашают в гости есть везде.

И получается такая ситуация, что даже если ты начал общаться с барышней, потом ей кто-то пришлет подобное,то она просто психанет и удалится или перестанет просто заходить на сайт. Думаю,что таким образом очень много девушек слилось.. Если в поиске забить что-то типа «отзывы про сайты знакомств», то есть много комментов типа, что ответов всегда мало. Что в наш век цифровых технологий знакомства давно ушли в онлайн, девушки сетуют,что на улице к ним никто не подходит,кроме пьяных охрабревших пацанчиков, что времена не те, что раньше было интереснее хотя раньше им было 15 лет,это в те времена,когда инета не было , что так не интересно..

Online Dating in Kotlas, Arkhangelskaya

Знакомства с телефоном Котлас

Котлас — секс знакомства | бесплатно и без регистрации

Телефоны шлюх волжский Любовник для состоятельной Телефоны московских шлюх Ищу привлекательную девушку Приеду Секс сайт домохозяйки. Ищу мужчину, женщину, пару, старше 45 Где познакомится со свободным мужчиной в челябинске Продам белье, беременная Хочу секса в ульяновске без регистрации Фиктивный брак с европейцем, Ищу парня из долгопрудного. Приглашаю г. Сайт шлюх и проституток питера Волосатые. Знакомства с азиатками Приглашаю мужчин на эротический массаж Ищу любовницу Содержанка сайт знакомств в витебске.

Секс знакомства Котлас: Интим объявления бесплатно без регистрации – сайт

Сдам квартиру Ищу девушку лси. Приглашу будущую любовницу на свидание- Девочки по вызову город псков телефоны Приеду в гости, есть подружки Телефоны шлюх в городе алматы. Познакомлюсь с госпожой Приглашаем в Санкт-Петербург в ночной стриптиз клуб Телефони шлюх тульчина кунилингус Любители кунилингуса в калуге. Новые знакомство в саратове номер телефона. Секс на один два раза Телефоны омских шлюх Телефоны замужних шлюх Массаж Познакомлюсь с девушкой от Брянск анал Не частые встречи по взаимной симпатии на нейтральной территории.

Релакс массаж Секс знакомства по номеру телефона. Проверены экспертами. Одобрены дорогами. Ваше имя: Укажите свое имя. Город: Укажите город. Email: Укажите корректный email адрес. Выбрать файл. Оптовые закупки легковых шин Оптовые закупки шин для коммерческого транспорта Вопросы по качеству, гарантии, помощь технического персонала Трудоустройство Предложение услуг Замечания по работе сайта Запросы прессы Другое. Текст сообщения. Бомж, бывший алкоголик, работы нет, зубов нет, наличности нет,и вообще ничего нет. Ищет умную, стройную, обеспеченную и любвиобильную свободную женщину.

Согласен на переезд, или спонсорскую помощь за страстные ночи любви!. Бомж с телефоном и интернетом Dmitry Neronov replied 3 replies. Svetlana Alexandrova. Knopka Kantselyarskaya. Стоит девушка на мосту, явно собирается свести счеты с жизнью. Подходит бомж. У меня так давно не было женщины!

Ты вААбще себя видел?

Или заполните короткую форму

Грязный, вонючий, вшивый! Нет, нет и нет! Уже ухожу. Тогда Я вас внизу подожду. Ищу тебя Котлас pinned post 9 Apr at am. Доброго время суток хотел бы познакомить свою сестру с мужчиной вес её 80 рост есть все.

Телефоны шлюх на одну ночь туймазы Знакомства для интима и секса в котласе без регистрации.

Ищешь себе девушку в городе Котлас (Архангельская область)? У нас более анкет с фото и телефонами онлайн, и суммарное количество. Знакомства Котлас онлайн | Знакомства Котлас без регистрации бесплатно Знакомства Котлас с фото и телефонами реальных людей.

Хотелось бы мужчину робочего вежливого астальное все будет. Анон админ спс.

Секс с девушкой для нее заключается в том, пускай засунуть ее как можно реже во влагалище. Привет, нужна девушка, которая по запросу сможет приезжать ко мне в офис или в… Посмотреть 26 лет Эта партнерша воплотит каждую вашу идею в кровати и не будет требовать продолжения свидания. Молодой горячий парень, студент, ищет горячую женщину для оральных ласк буду очень стараться для… Посмотреть 27 лет Чат знакомств 12 14 лет vagina video girl чат с англичанами онлайн бдсм секс видео чаты.

Для этого встречусь с парнем. Сохраненная копия.

Две красивые подруги ищут компанию из двух парней на субботний вечер. Смотреть каналы эротические онлайн бесплатно в хорошем качестве. Всем привет, я Ирина. Нравится рисовать комиксы, люблю вышивать и своими руками делать различные безделушки. Очень люблю играться с детьми и именно это меня надоумило на зарождение своих новых отношений. Цель моего появления на данном паблике — найти молодого, красивого, интересного парня, которого мне по-настоящему захочется любить и провести всю жизнь.

Отношения на одну ночь не интересуют. Не анон. Irina Strelkova. Nikolay Gusev. Насчёт детей опрометчиво сказала.

Знакомства для секса в Котласе

B этом году заканчивает 11класс и хочет идти работать на грузовую водителем. Download current versions of free browsers. Профиль компании. Find more profiles. Ищу работу Срочно нужна помощь! Ищу мужчину для серьезных отношенийМне 24 года живу в г. Анонимность записи определяется публикующим редактором в том случае, если в конце записи нету просьбы о анонимности имеются особые исключения. Я ищу мужчину. Александр26 Volkhov. Виктор, 58 лет, хочет пообщаться Познакомлюсь Я ищу спутника для общения Я обыкновенный чнловек. Я молодая, красивая девушка с большой грудью. Знакомства с телефоном Котлас будущую любовницу на свидание- Девочки по вызову город псков телефоны Приеду в гости, есть подружки Телефоны шлюх в городе алматы. Секс с девушкой для нее заключается в том, пускай засунуть ее как можно реже знакомства с телефоном Котлас влагалище.

Artem Krivoshapkin. Mikhail Grosse. Привет зовут Дима мне17 хочу найти подругу а потом как пойдет. Dima Krichuk.

Знакомства Котлас без Регистрации с Телефонами

Sofya Izyumova. Помогу расширить горизонты одинокому мужчине. Масажистка, так как мне 18 лет, опыта мало умные поймут пишите,звоните в любое время.

Знакомства в Котласе, частные объявления с фото на .
‘+videTitle+’.
Колеса Даром: Россия, Котлас, ул. Ленина, д. 165. кор. 2?
знакомства для веганов Мончегорск;
Other cities Arkhangelskaya.
Создайте свою учетную запись в один клик.

Anton Epimakhov. Софья , привет.

1. Введение

2. Молекулярная структура NRP

NRP — это эволюционно консервативные белки клеточной поверхности, которые экспрессируются всеми позвоночными и широко распространены во взрослых тканях [13,16]. Они образуют небольшое семейство, в основном состоящее из двух членов: NRP1 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 120 кДа, а NRP2 — трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 112 кДа [13,17,18,19,20]. Гены NRP1 и NRP2 кодируются в двух разных локусах на хромосомах 10p12 и 2q34 соответственно [21]. Из-за сплайсинга РНК существуют разные мембраносвязанные и растворимые варианты сплайсинга обоих NRP; особенно NRP2 существует в различных вариантах, NRP2A и NRP2B (Рисунок 1) [22,23,24,25,26].Это разнообразие дополнительно усиливается за счет необязательной вставки 5, 17 или 22 аминокислот с С-конца в аминокислоту 808 в проксимальной к мембране части эктодомена NRP. Внеклеточная часть NRP1 и NRP2 состоит из двух доменов гомологии кубилина (CUB) (a1 / a2), двух доменов FV / VIII (b1 / b2) и меприна / белка A5 / рецепторного белка-тирозинфосфатазы mu, или для короче, MAM (c) домен [16]. Домены CUB имеют значительную гомологию с фактором комплемента C1s / C1r, костным морфогенетическим белком 1 (BMP1) и толлоидными белками, тогда как домены FV / VIII гомологичны фактору свертывания крови FV / VIII, тирозинкиназе рецепторного типа DDR и дискоидин-1.Третий (c) домен часто называют доменом MAM, что соответствует аббревиатуре меприна, A5 (прежнее название NRP) и протеин-тирозинфосфатазы рецепторного типа mu и kappa (PTPμ, κ) [27,28] . Существуют растворимые варианты NRP, sNRP1 и sNRP2, состоящие только из этих тандемных a1 / a2 и тандемных b1 / b2 доменов, при отсутствии MAM-домена, а также трансмембранного и цитоплазматического доменов. Трансмембранный домен охватывает плазматическую мембрану один раз и связывает эктодомен со сравнительно короткой цитоплазматической областью, длина которой составляет 44 аминокислоты в случае NRP1 и 42 и 46 аминокислот в длину для NRP2A и NRP2B, соответственно.Ни один из заякоренных в мембране вариантов NRP не имеет цитозольного тирозинкиназного домена [16,22]. Вместо этого варианты, NRP1 и NRP2A, обладают мотивом связывания PSD-95 / Dlg / ZO-1 (PDZ) на своих внутриклеточных карбоксильных концах [16].

Оба белка NRP могут быть в разной степени гликозилированы в разных типах клеток [29,30,31]. Более того, NRP1 и NRP2 демонстрируют различные паттерны гликозилирования. NRP1 является N-гликозилированным и / или несет боковую цепь гликозаминогликана на Ser612 [31]. Эта боковая цепь представляет собой преимущественно хондроитинсульфат в клетках гладких мышц сосудов, тогда как NRP1 на эндотелиальных клетках пупочной вены человека в равной степени гликозилирован цепями хондроитинсульфата и гепарансульфата [29].Напротив, NRP2 не является протеогликаном, а скорее принадлежит к небольшой группе белков, которые могут быть полисиалированы. Такая посттрансляционная вариация полисиалирования наблюдается на дендритных клетках и определяет их доставку во вторичные лимфатические органы и их взаимодействие с Т-клетками [6,32]. Однако NRP1 также может быть полисиалированным, но только примерно вдвое слабее, чем NRP2 [33]. Структурное разнообразие NRP дополнительно усиливается протеолитическим процессингом «дезинтегрином и металлопротеиназами» ADAM9 и ADAM10 в ЭК.Это приводит к образованию заякоренных в мембране изоформ NRP, у которых отсутствуют внеклеточные тандемные домены a1 / a2 и b1 / b2 или даже домен MAM [34].

Две молекулы NRP нековалентно связываются в гомодимер, предположительно через их домен MAM и через мотивы в их α-спиральном трансмембранном домене [35,36]. В частности, α-спиральные трансмембранные домены выравниваются и, таким образом, вносят существенный вклад в гомодимеризацию [36,37]. Помимо гомодимеров, NRP1 и NRP2 также могут образовывать гетеродимеры [38].Пока неясно, происходит ли димеризация сразу после трансляции внутри ER или во время везикулярного транспорта на поверхность клетки.

3. Тканевое распределение NRP1 и NRP2

NRP1 и NRP2 по-разному распределяются в тканях. Впервые обнаруженный на нейрональных клетках центральной нервной системы, особенно в развивающемся эмбрионе, NRP1 также экспрессируется в кровеносных сосудах различных тканей, особенно в артериальных сосудах. На самых ранних стадиях развития NRP1 и NRP2 по-разному экспрессируются в артериях и венах, соответственно [39].Позднее в онтогенезе NRP1 экспрессируется в артериальных EC и в сосудистой сети опухоли, но не в венозных или лимфатических EC [40,41,42,43]. Во взрослых тканях он высоко экспрессируется в сердце и плаценте, умеренно экспрессируется в легких, печени, скелетных мышцах, почках и поджелудочной железе, а также в стромальных клетках костного мозга, остеобластах и кератиноцитах и слабо экспрессируется во взрослом мозге ([[ 13,44,45,46], https://www.uniprot.org/uniprot/O14786, дата обращения: 23 января 2019 г.).

NRP2, с другой стороны, экспрессируется в клетках, происходящих из нервного гребня, таких как гепатоциты и эпителиальные клетки проксимальных и дистальных почечных канальцев [47].В сосудистой сети он ограничен ЭК вен и лимфатических сосудов [41,42,43]. В частности, он экспрессируется субнабором ЭК во время опухолевого лимфангиогенеза [48], а также в опухолевых клетках, где его функция до сих пор неясна [49]. В отличие от NRP1, который с большей вероятностью экспрессируется карциномами, NRP2 скорее экспрессируется в опухолях нейронов и в меланомах [50].

NRP1-нокаут приводит к эмбриональной летальности из-за серьезных сосудистых дефектов с отсутствующими капиллярными сетями и неорганизованными кровеносными сосудами [15,51].NRP2-дефицитные мыши, с другой стороны, жизнеспособны с функциональной сосудистой сетью, но с сильно сокращенной системой лимфатических сосудов [51,52]. Кроме того, в остеобластах и остеокластах NRP участвуют в регуляции костного гомеостаза [53,54,55]. NRP2-нокаутные мыши страдают от низкой плотности костей из-за уменьшения количества остеобластов и увеличения количества остеокластов [53]. Оба NRP также обнаруживают совершенно разные паттерны экспрессии на разных иммунных клетках [6,56,57]. В то время как регуляторные Т-клетки (T _reg) и базофильные гранулоциты экспрессируют NRP1, дендритные клетки, макрофаги и микроглиальные клетки экспрессируют как NRP1, так и NRP2 [58,59].

Патологически NRP экспрессируются опухолевыми клетками различных видов рака, таких как рак мозга, груди, легких, толстой кишки, яичников и простаты, и они способствуют прогрессированию опухоли, предположительно из-за их регулирующей роли в ангиогенезе и подавлении иммунитета [13, 35,60,61,62,63,64].

Только за последние несколько месяцев экспрессия NRP1 была обнаружена при различных формах рака, включая плоскоклеточный рак полости рта [65], рак желудка [66], аденокарциному протока поджелудочной железы (PDAC) [67, 68], гепатоцеллюлярную карциному [ 69], холангиокарцинома [70,71], колоректальная карцинома [72], рак простаты [73] и рак груди [74].Кроме того, недавно сообщалось, что среди сарком клетки лейомиосаркомы экспрессируют NRP1 [75]. Кроме того, в меланоме [76,77] и при нейрональном раке, таком как глиобластомы [30,78,79], NRP экспрессируются и играют функциональную роль в прогрессировании опухоли. NRP2 высоко экспрессируется в лимфатических ЭК и строме многих опухолей, таких как глиобластома [78], плоскоклеточная карцинома полости рта и пищевода [80,81], аденоидно-кистозная карцинома слюнной железы [82], карцинома щитовидной железы [83], рак молочной железы [ 84], рак желудка [61], гепатоцеллюлярная карцинома [85], рак поджелудочной железы [86], колоректальный рак [87], рак мочевого пузыря [88], почечно-клеточная карцинома [89], рак простаты [90], остеосаркома [91] , рак легкого [92] и меланома [93], где он способствует лимфатическим метастазам за счет увеличения лимфангиогенеза опухоли и, таким образом, коррелирует со стадией опухоли, прогрессированием и плохим прогнозом [61].Плохая выживаемость пациентов также связана с тем фактом, что экспрессия NRP2B коррелирует с изобилием лиганда рецептора контрольных точек иммунных клеток PD-L1, переходом эпителия в мезенхиму (EMT) и приобретенной резистентностью к ингибиторам рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [94].

4. Потенциальные партнеры по взаимодействию с NRP: внеклеточные растворимые лиганды и тримерные комплексы с сигнальными рецепторами.

NRP разнообразны по своей структуре и по своему набору растворимых лигандов, которые они связывают, а также по своей способности образовывать холорецепторы с различными молекулами корецепторов для модуляции важных функции клеток (рис. 2) [95].Эти разнообразные комбинации обладают разным сродством к разным лигандам, например, гомодимеры Nrp1 предпочтительно связывают SEMA3A, тогда как гомодимеры NRP2 распознают SEMA3F [96]. Более того, после связывания лиганда они могут образовывать супрамолекулярные белковые комплексы в клеточной мембране [97]. Благодаря своей модульной структуре NRP представляют сайты связывания для различных лигандов, которые, следовательно, не обязательно должны конкурировать за связывание с NRP. За счет привлечения рецепторных киназ NRP действуют как корецепторы, несмотря на отсутствие внутриклеточного киназного домена, и передают стимулирующие или ингибирующие сигналы, в зависимости от задействованного растворимого лиганда и рецепторной киназы.

4.1. Взаимодействие NRP1 с VEGF и VEGFR

Среди лигандов сигнальных комплексов, содержащих NRP1, VEGF-A является наиболее понятным партнером по связыванию NRP1 и формирует молекулярную основу для разработки фармацевтических соединений, которые влияют на связывание VEGF-A с NRP1 / Комплекс VEGFR2 [100,101]. Такие фармакологические соединения могут помочь подавить ангиогенез опухоли в опухолях и лечить другие заболевания, ключевой особенностью которых является ангиогенез, например возрастная дегенерация желтого пятна, ревматоидный артрит, псориаз, неоваскуляризация глаза, вызванная диабетом, воспалительные заболевания, ишемия / реперфузионное повреждение. , детская гемангиома и атеросклероз [102].

VEGF-A, кодируемый в локусе гена на хромосоме 6p21.1, встречается в шести различных вариантах сплайсинга [103]. Все изоформы VEGF-A содержат аминокислотные последовательности, которые кодируются первыми пятью экзонами и содержат соответствующие остатки для связывания с рецепторами VEGF, VEGFR1 и VEGFR2 [102]. Однако не все варианты сплайсинга VEGF-A могут связываться с гликозаминогликановыми цепями белков внеклеточного матрикса (ECM) или связываться с NRP1, поскольку соответствующие остатки расположены в экзонах 6 и 7, а также в экзонах 7 и 8a, соответственно [102].Следовательно, NRP1 связывает варианты сплайсинга VEGF-A VEGF-A ₁₆₅ и VEGF-A ₁₈₉, но не более мелкие варианты с длиной 145, 121 или 120 аминокислот [13,104,105,106,107,108]. Примечательно, что NRP2 связывает VEGF-A ₁₄₅ в дополнение к VEGF-A ₁₆₅, но не VEGF-A ₁₂₁ [109]. Две молекулы VEGF-A образуют димер через две межцепочечные дисульфидные связи [110], которые затем могут связываться с гомодимерными рецепторами VEGF-A VEGFR1 и VEGFR2 в комплексе с гомодимером NRP1.Таким образом, тройной комплекс VEGF-A / VEGFR / NRP1 образуется с предполагаемой стехиометрией 2: 2: 2 [102,111]. Четыре несмежных аминокислоты, два аргинина и два остатка глутамата в С-концевой части молекулы VEGF-A ответственны за связывание с VEGFR с высоким сродством в наномолярном диапазоне [100,101,102,112]. C-концевой остаток аргинина VEGF-A ₁₆₅ имеет особое значение, поскольку он связывается со связывающим карманом в домене NRP1-b1, образованном боковыми цепями остатков Y297, Y353, D320, S346 [100,101].Некоторые другие лиганды NRP1 также обладают таким C-концевым остатком аргинина, что приводит к формулировке правила карбоксиконцевого конца (CendR), согласно которому NRP1 распознает пептиды с C-концевым остатком аргинина с его связывающим карманом в его домене b1. [40].

Вариант фактора роста сосудистого эндотелия длиной 165 аминокислот (VEGF-A ₁₆₅) был впервые идентифицирован как лиганд для NRP1 [13]. В отличие от своего более короткого варианта сплайсинга VEGF-A ₁₂₁, димерный VEGF-A ₁₆₅ связывается своими С-концами с тандемным доменом NRP1 b1 / b2 и одновременно с эктодоменом рецептора VEGF-2 (VEGFR2) [13,104,105,106,107 ].В результате димерный NRP1 и димерный рецептор VEGFR2 вступают в тесный контакт, что обеспечивает взаимное взаимодействие всех белков-партнеров в тройном сигнальном комплексе VEGF-A ₁₆₅ / VEGFR2 / NRP1 [113]. Этот комплекс преимущественно обнаруживается в артериальных ЭК, где он способствует ангиогенному разрастанию [114]. Хотя VEGF-A ₁₂₁ также может напрямую связываться с NRP1, он неспособен индуцировать образование холорецептора NRP1 / VEGFR2 [115].

Репертуар лигандов NRP2 в семействе VEGF включает VEGF-A ₁₄₅ и VEGF-C.Связывая свой лиганд, NRP2 образует тройной комплекс с VEGF-C и VEGFR3 на лимфатических ECs и участвует в лимфангиогенезе [61, 116].

4.2. Взаимодействие NRP1 с другими рецепторами фактора роста

Недавно сообщалось о других растворимых лигандах и других рецепторах-партнерах NRP1, демонстрирующих удивительную универсальность NRP1 в этом отношении. Интересно, что при связывании с несколькими факторами роста, отличными от VEGF-A, NRP1 становится корецептором для соответствующего рецептора фактора роста, тем самым способствуя образованию тройного сигнального комплекса.Таким образом, следующие факторы роста и рецепторы могут взаимодействовать с NRP1: фактор роста плаценты (PlGF), который является членом семейства белков VEGF, и его рецептор PlGFR [117,118], фактор роста гепатоцитов / фактор рассеяния (HGF / SF). ) и его рецептор MET [119, 120], фактор роста фибробластов-2 (FGF-2, также известный как основной фактор роста фибробластов, bFGF) [121], фактор роста кератиноцитов (KGF) [122], тромбоцитарные факторы роста C и D (PDGF-C и PDGF-D) [77,123,124], а также трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) [125,126,127] и их соответствующие рецепторы.Хотя сам NRP1 не связывает эпидермальный фактор роста (EGF), его внеклеточный домен, тем не менее, регулирует связанные с лигандом олигомеризацию EGFR и эндоцитоз [3].

За исключением сериновых киназ рецепторного типа TGF-βRI и TGF-βRII, которые активируют SMAD2 и SMAD3, все рецепторы фактора роста, связанные с NRP1, представляют собой тирозинкиназы рецепторного типа, которые аутофосфорилируют при агонистической стимуляции и привлекают адаптерные белки для запуска внутриклеточного сигнальный каскад [127].Как часть этого холорецепторного комплекса, NRP1 играет роль сватчика факторов роста и родственных им рецепторов и влияет на их взаимодействие. Функциональный рецептор SEMA3A в ЭК, например, состоит из трехкомпонентного комплекса NRP1 с plexinA1 и plexinD1 [128].

4.3. Взаимодействие NRP с семафоринами и плексинами

Более того, некоторые члены семейства семафоринов также связываются с NRPs [95,129]. Как физиологические медиаторы антиангиогенных сигналов, они играют ингибирующую роль в ангиогенезе опухоли и росте опухоли в дополнение к их участию в развитии нейронов в качестве растворимых хемопеллентов [130].

Семафорины класса 3, SEMA3A-G, являются секретируемыми членами большого семейства факторов, регулирующих процессы, такие как онтогенез и ангиогенез опухоли, посредством передачи сигналов через рецепторы, состоящие из NRP1 или NRP2 и plexinA или plexinD соответственно [63] . ЭК экспрессируют все четыре А-плексина в разной степени, причем наиболее сильно экспрессируется plexinD1 [98,128]. SEMA3A связывается с NRP1-содержащими холорецепторами, а SEMA3F связывается с NRP2-содержащими холорецепторами, тем самым способствуя нормализации сосудистой сети рака и ингибируя метастазирование [131, 132].Напротив, SEMA3C связывается как с NRP1, так и с NRP2 со сходной аффинностью [133].

Семафорин SEMA3A связывается с тандемным доменом a1 / a2 NRP1 и вызывает коллапс и ретракцию конуса роста нервов [134]. Взаимодействие NRP с плексином в основном опосредуется мотивами внутри трансмембранных доменов [135]. Кроме того, юкстамембранные области NRP, включая домен MAM, также вносят вклад в поверхность контакта с рецепторами-партнерами. [16]. SEMA3A связывается как гомодимерная молекула с димерным комплексом NRP1 / plexinA1 в стехиометрии 2: 2: 2 [136].В этом комплексе межцепочечная контактная поверхность несвязанного димера SEMA3A, которая образована верхней поверхностью его 7-лопастного домена β-пропеллера (домен SEMA), нарушена. Вместо гомофильного взаимодействия внутри SEMA3A-димера димер SEMA3A открывается и обеспечивает доступ тандемному домену NRP a1 / a2 к верхней поверхности его SEMA доменов [136]. Как следствие, две молекулы plexinA1, которые также взаимодействуют через свои домены SEMA с более проксимальными к мембране доменами димера NRP1, взаимодействуют с доменами SEMA связанного с NRP1 SEMA3A и претерпевают конформационные изменения.В результате открываются сайты аутоингибиторного контакта в plexinA1. Активируемые таким образом, они запускают внутриклеточный сигнал, который в конечном итоге приводит к коллапсу конуса роста в нейронах [137]. В этой модели NRP1 не только служит в качестве согласователя между семафориновым лигандом и рецептором плексина, но также действует как вспомогательный белок, который помогает в преобразовании гомофильного взаимодействия SEMA-домена в димере SEMA3A в гетерофильное взаимодействие между SEMA-доменами SEMA3A и плексина A1.

NRP2 был первоначально описан как рецептор для SEMA3F (в то время называемый семой IV), который опосредует его отталкивающий эффект на растущие нейроны и способен образовывать гетероолигомеры с NRP1 [97].По сравнению с NRP1, репертуар лигандов NRP2 в семействе семафоринов более ограничен и, помимо SEMA3F, также включает SEMA3G, тогда как семафорины SEMA3B, SEMA3C и SEMA3D могут взаимодействовать как с NRP1, так и с NRP2 [138].

4.4. Взаимодействие NRP1 с Integrins.

Сообщалось также, что интегрины взаимодействуют с NRPs [114,139,140,141,142]. Они представляют собой семейство молекул клеточной адгезии, которые состоят из двух субъединиц, α и β, обе из которых охватывают клеточную мембрану с α-спиральным трансмембранным доменом [143,144].Две субъединицы интегрина образуют внеклеточный головной домен, несущий сайт связывания для лигандов ЕСМ [145, 146, 147]. Головной домен соединен двумя ножками, которые образуются каждой цепью с трансмембранным доменом [143,144]. После связывания лиганда с головным доменом интегрины претерпевают драматические изменения конформации, тем самым передавая сигналы между ЕСМ и клеткой [144,148]. Подобно NRP, интегрины лишены внутриклеточного киназного домена. Связывание лиганда вызывает кластеризацию интегрина в супрамолекулярные комплексы, называемые адгесомами [149, 150].Следовательно, цитоплазматические домены интегринов рекрутируют адаптерные белки и сигнальные молекулы для прикрепления цитоскелета и передачи сигнала, соответственно [148,151]. Обсуждались различные возможности взаимодействия интегринов с NRP: межклеточное взаимодействие между интегринами α5β1 и α9β1 на раковых клетках с NRP2 в качестве контррецептора на ECs усиливает распространение опухолевых клеток и метастазирование [87,152]. В других сообщениях описывается латеральное взаимодействие интегрина α6β1 с NRP2 на раковых клетках и интегрина α5β1 с комплексом VEGFR2-NRP1 на ЭК [114, 139, 140, 142, 153].Последний даже усиливает опосредованное интегрином α5β1 ремоделирование фибронектинового матрикса [141]. Однако пока не ясно, могут ли интегрины вступать в прямой физический контакт с NRP1, подобно комплексному образованию NRPs с рецепторными киназами [114,153]. Независимо от такого потенциального прямого контакта, NRPs обнаруживаются в интегрин-содержащих мультибелковых комплексах адгезом [142,153]. Это объясняет регуляторное взаимодействие между интегринами и NRP, например, в усилении регуляции связывающего коллаген интегрина α2β1 при стимуляции NRP1-агонистом SEMA3A в клетках рака молочной железы [154], усиление экспрессии интегрина αvβ3 при блокировании NRP1 [155] ], и, наоборот, ингибирующая секвестрация NRP1 из сигнального комплекса NRP1-VEGFR2 с помощью интегрина αvβ3 в ECs [156].Более того, NRP1 влияет на реакцию связывания интегрина αvβ3 с тенасцином С, модулирующим адгезию ЕСМ-белком, в клетках рака молочной железы [74].

4.5. Взаимодействие NRP1 с другими молекулами

Другим корецептором NRP1 является молекула адгезии клеток L1 (L1CAM), которая принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), опосредует межклеточные контакты между нейронами и взаимодействует с NRP как цис-, так и трансклеточным образом [157,158 ]. Α-спиральные трансмембранные домены L1CAM и NRPs вероятно обеспечивают физическое взаимодействие между обоими белками [132].Ассоциация NRP1 с L1CAM запускает разборку адгезом в ростовых конусах и последующий коллапс ростовых конусов за счет рекрутирования и активации сигнального каскада FAK / MAPK [159]. Точно так же на нейронах NRP взаимодействуют с рецептором нейротрофина p75 и, таким образом, регулируют апоптоз нервных клеток и ингибирование роста миелина [160].

Гепарин и гепарансульфат были описаны как партнеры по связыванию нейропилинов [13]. Гепарин по крайней мере из восьми моносахаридных единиц может напрямую связываться с NRP1, и он значительно усиливает связывание VEGF-A ₁₆₅ и PlGF-2 с доменом b1b2 NRP1, когда длина его цепи составляет не менее 20–24 моносахаридов [118] .Физически взаимодействуя как с лигандом, так и с рецептором, он является важным регулятором взаимодействия VEGF-A ₁₆₅ и PlGF-2 с NRP1 на ЭК [118]. Поскольку NRP1 обладает сайтом-миметиком «гепарина», который может взаимодействовать с сайтом связывания гепарина различных белков, таких как FGF-2 и HGF, NRP1 способен регулировать активность этих связывающих гепарин белков [121]. Гепарансульфат, а не гепарин, является естественным полисахаридом клеточной поверхности in vivo. Таким образом, гепарин-связывающие изоформы VEGF-A, например, которые дифференциально секвестируются гепарансульфатными протеогликанами в ЕСМ, могут высвобождаться из ЕСМ и связываться с гепарансульфатными протеогликанами на поверхности ЕС для регулирования передачи сигналов NRP1 и VEGFR и ангиогенеза [161, 162, 163, 164]. ].

NRP1 также является мишенью для растворимых токсинов, таких как субъединица αβ родоцетина, компонента яда малайской гадюки (Calloselasma rhodostoma). Родоцетин αβ (RCαβ) был идентифицирован как первый неферментативный компонент змеиного яда, который распознает NRP1 на ЭК [166]. Этот белок, связанный с лектином С-типа, связывается с тандемным доменом b1 / b2 NRP1 и индуцирует образование тройного комплекса с МЕТ на мембранах эндотелиальных и опухолевых клеток [166]. Подобно физиологическому лиганду MET, HGF, родоцетин-αβ тем самым изменяет адгезомы и увеличивает подвижность клеток [166, 167].

4.6. NRP1 может транс-взаимодействовать с лигандами на соседних клетках

Хотя большинство взаимодействий между NRP и их корецепторами происходит через латеральные контакты в плазматической мембране одной и той же клетки, в нескольких отчетах также описывается транс-взаимодействие NRP на одной клетке с коцепторами. -рецептор на соседней клетке [68]. Такие межклеточные взаимодействия происходят между EC-заякоренным VEGFR2 и NRP1 опухолевых клеток [68, 168]. Сходным образом они были описаны для иммунного синапса с его тесным взаимодействием между антигенпрезентирующими дендритными клетками и клетками T _reg, экспрессирующими мембраносвязанные SEMA4A и NRP1, соответственно [169, 170].Примечательно, что NRP1 может переноситься от ЭК к Т-лимфоцитам путем образования иммунного синапса, после чего Т-клетки начинают экспрессировать VEGF-A ₁₆₅, который, в свою очередь, усиливает передачу сигналов через транс-взаимодействие NRP1 / VEGFR2 в ЭК во время воспаления [ 171].

5. Сигнальные и (пато) физиологические функции NRP

NRP представляют собой многофункциональные нетирозинкиназные рецепторы для VEGF, TGFβ и семафоринов, которые, помимо своей роли в управлении аксонами, связаны с пролиферацией опухоли, ангиогенезом и выживанием посредством запускающие пути передачи сигнала, способствующие росту (рис. 3) [90,158,159].Со своими внеклеточными доменами NRP могут действовать в качестве сватов и эффекторов для связывания различных рецепторов факторов роста с соответствующими лигандами, поскольку они влияют на специфичность и сродство NRP-содержащего холорецептора. Более того, они могут способствовать представлению сайтов взаимодействия между лигандом и рецепторами, таких как поверхность контакта SEMA между лигандом SEMA3A и плексином A1. Другой способ вызвать эффект состоит в том, что NRP1 может регулировать транспортировку VEGFR или может секвестрировать лиганд VEGF-A за счет своей способности взаимодействовать со своими белками-партнерами через внеклеточные домены [172,173].Напротив, цитоплазматический домен NRP1, по-видимому, не является решающим в запуске NRP1-автономной передачи сигнала, поскольку модель на мышах, экспрессирующих усеченный цитоплазматическим доменом NRP1, показывает только незначительные сосудистые дефекты в отличие от летального фенотипа и нескольких сосудистых заболеваний. пороки глобального нокаута всей молекулы NRP1.

5.1. NRP модулирует передачу сигналов тирозинкиназы рецептора

В качестве корецептора рецепторов VEGF -1 и -2, NRP1 модулирует передачу сигналов VEGF и независимым от рецептора VEGF образом в качестве корецептора плексина-A опосредует хеморепульсантную активность семафоринов [13, 175]. ].Раковые клетки солидных опухолей экспрессируют различные уровни VEGFR1, но вряд ли VEGFR2 и -3, поэтому они, вероятно, связывают VEGF-A в основном через NRP1 [172,173,176,177]. До сих пор неясно, существует ли VEGFR-независимая передача сигналов NRP1 / VEGF-A в ECs [163,164]. В тримерном комплексе NRP1 / VEGFR2 / VEGF-A передача сигналов, вероятно, происходит посредством взаимного фосфорилирования цитоплазматических хвостов двух молекул рецептора VEGFR2 внутри комплекса, что активирует киназные домены и приводит к активации фосфорилирования нижестоящих сигнальных молекул.В сигнальной трансдукции задействованы две основные оси активации PI3-киназы, включая протеинкиназу B (AKT), и PLCγ, включая RAS-RAF-ERK [114, 164].

Напротив, клетки рака кожи, рака простаты и глиобластомы в значительной степени лишены рецепторов VEGF -1 и -2. Следовательно, VEGF-A-индуцированная активация RhoA зависит главным образом от NRP1 [176]. Йошида и соавторы продемонстрировали, что связывание VEGF-A с NRP1 вызывает взаимодействие NRP1 с каркасным белком GIPC1. Это способствует образованию молекулярного комплекса GIPC1 и Syx, фактора обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) для RhoA, что приводит к увеличению GTP-связанной активной формы RhoA [176, 178].В ECs, с другой стороны, активация RhoA, опосредованная NRP1, стимулирует подвижность клеток посредством пути PI3K [179]. VEGF-A в микроокружении опухоли влияет на экспрессию ЭК RhoGEF [180]. Повышенные уровни активных RhoA и ROCK в опухолевых ЭК из-за нарушенного восприятия механических сил между ними и окружающими их ВКМ способствуют нарушению васкуляризации [181]. Следовательно, вмешательство в сигнальный путь VEGF-A-RhoA может быть многообещающим для лечения рака [178]. Для индуцированной VEGF-C активации AKT должен образовываться VEGFR3 / VEGFR2 / NRP1, тогда как ERK1 / 2 активируется в основном NRP-независимо [182].

В опухолевых клетках EGF индуцирует экспрессию NRP1 [183,184,185]. В свою очередь, NRP1 может образовывать комплекс с EGFR, который сверхэкспрессируется и активен во многих раковых клетках. EGFR, также известный как Her2 и ErbB2 (онкоген B Erythroblasotsis), представляет собой RTK семейства EGFR, который может формировать холорецепторы с EGFR, ErbB3 и ErbB4 [186]. Примечательно, что эктодомен NRP1 способен избирательно запускать фосфорилирование EGFR, не препятствуя активации рецепторов, индуцированной EGF [3]. EGF и TGF-β, соответственно, индуцируют NRP1-зависимую кластеризацию EGFR и эндоцитоз, приводя к передаче сигналов AKT [3].Эндоцитоз EGFR, связанного с плазматической мембраной, контролируется независимо от аутофосфорилирования тирозина посредством олигомеризации и кластеризации рецепторов, опосредованных NRP1 [3]. Анти-EGFR-терапия в контексте лечения рака может иметь кардиотоксические побочные эффекты, возможно, из-за дисфункции ЭК, потому что EGFR, который обычно участвует в передаче сигналов EGF / нейрегулина, также может формировать холорецептор с NRP1 и вызывать репеллентный сигнал SEMA3D в венозной крови. ЭК [187].

NRP2 также регулирует количество EGFR на поверхности раковых клеток, тем самым контролируя EGF-опосредованную передачу сигналов и ответ на терапию, направленную на EGFR [188].Повышенная экспрессия NRP2 приводит к подавлению EGFR, замедлению роста опухоли и подавлению пути «спасения» EGFR опухолевых клеток, который включается как защитный ответ на терапию опухолей, направленную на MET [188]. Соответственно, развитие устойчивости к терапии, направленной на МЕТ, связано с потерей NRP2 и, таким образом, активацией передачи сигналов NFκB [188]. В то же время, EGFR-ассоциированный белок, миграция клеток, индуцирующий гиалуронидазу 1 (CEMIP, KIAA1199), которая противодействует деградации активированной киназы EGFR, подвергается усиленной регуляции [188].

Роль NRP1 как корецептора для FGFs в сосудистой сети (опухоли) все еще неясна, поскольку NRP1 может связывать несколько FGFs [121], но не влияет на индуцированную FGF-2 пролиферацию HUVECs [96]. По-видимому, SEMA3A ингибирует индуцированную FGF-2 активацию ERK1 / 2, способствующую пролиферации, в ECs ниже RTKs [96].

Взаимодействие NRP1 с PDGF-A и -B может иметь отношение к EMT [172,189]. Стимулируемый PDGF, а также VEGF и HGF, NRP1 способствует фосфорилированию p130Cas через его цитоплазматический домен и, таким образом, подвижность клеток, независимо от GIPC1 [31,189,190,191,192,193].PDGF-D может связываться с NRP1 и индуцировать образование холорецептора с PDGFRβ, тем самым стимулируя пролиферацию фиброзных процессов и различных видов рака [179,194,195,196]. С помощью PDGF-D NRP1 перемещается независимо от PDGFRβ в межклеточные соединения, тем самым снижая передачу сигналов VEGFR2 [124]. Взаимодействие между NRP1 и PDGFRβ, индуцированное PDGF-D, также может происходить в транс между ECs и PC [124].

NRP1 и NRP2 могут также взаимодействовать как корецепторы для HGF с рецептором фактора роста гепатоцитов / рецептором фактора рассеяния MET на ЭК [120,197].HGF стимулирует через NRP1 фосфорилирование тирозина p130Cas, подвижность и пролиферацию ЭК [193]. В клетках карциномы NRP1 необходим для активации путей, способствующих росту и инвазивности опухоли, включая p38MAPK, Src и PI3K, а также для интернализации комплекса NRP1 / Met [119].

Часто онкогены переключают сигнальные пути таким образом, что они становятся важными регуляторами пролиферации и выживания опухолевых клеток, что называется зависимостью от онкогенов [198]. Подавление NRP2 в зависимых от MET клетках приводит за счет компенсаторного усиления передачи сигналов EGFR к EGFR-зависимой устойчивости к таргетной терапии [188].Поскольку NRP1 является беспорядочным корецептором для различных рецепторов факторов роста, его истощение или инактивация может ингибировать различные сигнальные каскады, начиная с VEGFR2, EGFR и MET, и, таким образом, может способствовать сдерживанию пролиферации клеток и ангиогенеза опухоли и зависимости от онкогенов. Эта стратегия кажется выполнимой и подкрепляется следующими наблюдениями. В модели рака желудка у мышей с ксенотрансплантатом истощение NRP1 вызывает повышенную регуляцию p27 и подавление циклина E и циклин-зависимой киназы-2 (CDK-2) и, таким образом, остановку клеточного цикла в фазе G1 / S [199].Кроме того, подавление NRP1 противодействует побочным эффектам приобретенной устойчивости к ингибиторам EGFR, MET и BRAF (крыса / быстроразвивающаяся фибросаркома, изоформа B), поскольку NRP1 активирует альтернативные стимулирующие опухоль эффекторные киназы EGFR и IGF1R (инсулиноподобные рецептор фактора роста 1), соответственно, через c-Jun N-концевую киназу (JNK) -зависимый сигнальный каскад [200].

5.2. NRP модулирует передачу сигналов рецептора TGF-β

NRP1 может функционировать как корецептор для TGFβ, образуя холорецепторы с TGFβ-рецепторами I, II и III [126, 201].Образуя холорецептор для TGF-β, NRP1 / TGF-βR может контролировать ангиогенное разрастание независимо от VEGFR2 [202, 203].

NRP1 имеет отрицательно заряженную щель в своем домене b1, которая позволяет связывать различные лиганды, такие как TGF-β [28,125]. NRP1 на клетках рака молочной железы связывает как латентный, так и активный TGF-β1 с высоким сродством [125]. Связывание TGF-β с помощью NRP1 способствует фенотипу миофибробластов [125, 201]. Подавление NRP1 в стромальных фибробластах снижает индуцированное TGF-β фосфорилирование SMAD2 / 3 и, следовательно, экспрессию α-актина гладких мышц [126, 201].Как недавно было рассмотрено, передача сигналов TGF-β и Ras сходится и отвечает за экспрессию NRP1 [127]. Снижение экспрессии NRP1 в клетках, трансформированных KRAS, приводит к снижению фосфорилирования SMAD2 и увеличению роста опухоли [127, 204]. В клетках рака молочной железы уровни TGFβ, а также нижестоящая экспрессия NRP1 и SMAD-2 негативно регулируются микроРНК (miR) -206, а сверхэкспрессия miR-206 ингибирует ЕМТ, а также миграцию и инвазию клеток рака молочной железы [205 ]. Опосредованное TGFβ1 ингибирование miR-196a-3p и последующая активация NRP2 способствует метастатическому фенотипу клеток рака груди [206].

5.3. NRP модулирует передачу сигналов семафорина / плексина

Связывание и передача сигналов VEGF и родственных факторов роста, по-видимому, противодействуют семафоринам класса 3 [16]. Кроме того, растворимые изоформы NRP модулируют эти сигнальные процессы [16].

Хотя NRP1 является специфическим лигандом SEMA3A, NRP1 с его коротким внутриклеточным доменом не может передавать сигналы SEMA3A сам по себе, но полагается на образование комплексов с рецепторами плексина [207]. Связывая Sema3, малые GTPases, такие как R-Ras, инактивируются внутриклеточным доменом плексина, который затем способствует интегрин-опосредованному взаимодействию клетка-матрикс [63,208].

Связываясь с NRP1 и plexinD1 в ЭК, SEMA3C вызывает интернализацию VE-кадгерина и отключение VEGF-индуцированной передачи сигналов через AKT, FAK, а также p38MAPK, что затем вызывает разборку соединений ЭК и фокальных адгезий и связанную с ними перестройку цитоскелета [209]. ]. Таким образом, передача сигналов SEMA3C может индуцировать апоптоз ЭК и ингибировать патологический ангиогенез [209]. При раке SEMA3C и его рецепторы часто сильно экспрессируются и связаны с инвазией и метастазированием [210].

клетки меланомы, сверхэкспрессирующие SEMA3F, образуют плохо васкуляризованные опухоли, потому что Nrp2 ингибирует развитие опухоли и метастазирование с помощью сильного антиангиогенного каскада [211, 212].В ЭК предраковых поражений SEMA3A является эндогенным ингибитором ангиогенеза, экспрессия которого теряется во время прогрессирования опухоли [133]. Передача сигналов NRP2 при аденокарциноме поджелудочной железы способствует ангиогенезу опухоли за счет увеличения уровней Jagged1 [86]. Сверхэкспрессия Jagged1 в раковых клетках способствует неоваскуляризации и росту экспериментальных опухолей у мышей [213]. Jagged1 является важным регулятором образования концевых клеток в ангиогенном эндотелии из-за его способности модулировать передачу сигналов Delta-like 4 (Dll4) -Notch [214].

Рекрутирование перицитов в формирующиеся сосуды важно для развития, стабилизации и созревания сосудистой сети [215,216,217] и зависит, среди прочего, от передачи сигналов SEMA3A / NRP1 [218,219]. В опухолевом ангиогенезе in vitro инвазивные раковые клетки привлекают меньше перицитов, чем неинвазивные раковые клетки [192]. NRP1 участвует в качестве корецептора PDGF-B в дифференцировке перицитов от мезенхимальных стволовых клеток [192]. По сравнению с нормальными кровеносными сосудами, сосудистая сеть опухоли имеет сравнительно небольшое количество перицитов, что является одной из причин их неплотности [220].Экспрессия SEMA3A нормализует покрытие перицитов и в то же время снижает ангиогенез и рост опухоли [218, 221].

5.4. NRP модулирует передачу сигналов интегринов.

NRP взаимодействуют со специфическими интегринами и активируют их для связывания с молекулами ECM [139, 156, 222]. Интегрины также лишены сигнального домена, но связаны внутри адгезом с различными киназами, такими как члены семейства Src и киназа фокальной адгезии (FAK) [223]. NRP1, как корецептор VEGFR2, может модулировать ось передачи сигналов PI3K / AKT / PTEN, которая активирует передачу сигналов интегринов β1, β3 и β5 изнутри наружу [224].И NRP1, и NRP2 могут напрямую связываться с интегринами β1 [90,142,225]. NRP модулирует специфические интегрины, способствующие инициации и прогрессированию опухоли, такие как α2β1, α5β1 и β3 [153]. В клетках рака молочной железы, экспрессирующих SEMA3A, аутокринная петля обратной связи активирует серин / треонинкиназу GSK-3 через NRP1 и, таким образом, экспрессию интегрина α2β1, тем самым ослабляя миграцию и инвазию [154]. Сходным образом ингибирующие аутокринные петли SEMA3 точно настраивают интегрин α5β1- и αvβ3-опосредованную адгезию к ECM, чтобы придать EC необходимую гибкость и подвижность во время ангиогенеза [225].В ECs взаимодействие между NRP1 и a5β1 опосредуется GIPC1, который связывает эти два рецептора путем связывания с последовательностями связывающего домена PDZ в их цитоплазматических хвостах [139]. Во время миграции клеток SEMA3A связывается с холорецептором NRP1 / plexinD1 в содержащих интегрин фокальных комплексах в динамических клеточных выступах и там модулирует активность интегрина α5 [139,225]. Здесь домен плексина внутриклеточного белка активации GTPase (GAP) активирует небольшую GTPase Rap1 (Ras-related protein), которая способствует с помощью эффекторных белков, таких как RIAM1, конформационной активации интегринов через талин [226].Ангиогенез можно регулировать путем комплексообразования интегринов β3 с NRP1, тем самым уменьшая количество холорецепторов NRP1 / VEGFR2, доступных для передачи сигналов VEGF-A [156].

Аналогичным образом, NRP2-опосредованная передача сигналов VEGF в клетках рака груди и карциномы простаты подвергается модуляции интегрином α6β1 [90, 227]. Передача сигналов NRP2 / VEGF активирует путь TORC2 / PKC, который активирует интегрин a6β1 и способствует его ассоциации с F-актином, возможно, посредством фосфорилирования субъединицы интегрина α6 [227, 228, 229].Это затем запускает образование фокальных спаек и, следовательно, позволяет передавать сигналы фокальной адгезии [227]. В клетках карциномы молочной железы передача сигналов NRP2 / VEGF косвенно увеличивает FAK за счет активации интегрина α6β1 [227]. NRP1 также может образовывать тройной комплекс с GIPC1 и интегрином α6β4 [226]. Через этот комплекс VEGF-A может запускать передачу сигналов FAK / Src в стволовых клетках эпидермального рака. Это стабилизирует YAP1 / ΔNP63α и, таким образом, увеличивает выживаемость, инвазивность и ангиогенез опухоли [226].

5.5. NRP модулирует передачу сигналов других внеклеточных лигандов

Галектины представляют собой β-галактозид-связывающие белки с в основном ангиостимулирующей активностью, возможно, за счет модуляции эндоцитоза рецепторов [230, 231].В отличие от VEGFR-связывающего галектина 3, NRP1 напрямую связывает галектин 1, который сверхэкспрессируется в ассоциированных с опухолью капиллярных ЭК при плоскоклеточной карциноме [232]. Это связывание увеличивает пролиферацию и адгезию EC за счет усиления фосфорилирования VEGFR2 и запуска передачи сигналов через киназы MAP SAPK1 и Jnk. В сочетании с VEGF миграция клеток дополнительно увеличивается [232].

Связывание компонента змеиного яда, родоцетина αβ (RCαβ) с NRP1, индуцирует образование тройного комплекса с МЕТ на мембранах эндотелиальных и опухолевых клеток [166].Это приводит к фосфорилированию МЕТ по Y1234 / 1235 и, посредством последующего фосфорилирования паксиллина по Y31, вызывает перестройку якорных комплексов фокальных адгезий между клеткой и матрицей в фокальные контакты и реорганизацию актинового цитоскелета, тем самым снижая адгезивность клеток и увеличивая подвижность клеток [166, 167]. ]. В моделях опухолей in vivo RCαβ селективно разрушает кровеносные сосуды опухолевых тканей, но не нормальных тканей, вызывая реакции сначала опухолевых клеток, а затем ЭК микроокружения опухоли [167].

5.6. Влияние внутриклеточных партнеров и PDZ-связывающих белков на передачу сигналов NRP

После связывания VEGF, NRP1 запускает активацию RAS и последовательное фосфорилирование ERK1 / 2 и AKT [233]. Примечательно, что KRAS дикого типа обнаруживается в опухолях, где NRP1 обладает способствующими опухоли свойствами, тогда как в опухолях, где NRP1 действует как опухолевый супрессор, обнаруживаются онкогенные мутации KRAS [52]. Онкогенная передача сигналов KRAS и TGF-β индуцирует основной фактор транскрипции Snail, который подавляет транскрипцию E-кадгерина [127, 234].Более того, в клетках с онкогенными, но не с KRAS дикого типа, TGF-β подавляет NRP1 как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции [204]. Такое подавление NRP1 в онкогенно трансформированных KRAS клетках способствует росту опухоли за счет снижения фосфорилирования SMAD2 [204].

Связывание GIPC1 с цитоплазматическим мотивом SEA (Ser-Glu-Ala) NRP стимулирует интернализацию интегрина α5β1 в Rab5-положительных ранних эндосомах [139]. Более того, этот комплекс GIPC1-интегрин α5β1 также взаимодействует с моторным белком миозина VI, тем самым способствуя адгезии ЭК к фибронектину и эндоцитозу интегрина a5β1 [139].

5.7. Передача сигналов NRP регулируется эндоцитозом.

Мембранный перенос также играет ключевую роль в регуляции сигнальных путей [235]. Эндоцитоз является важным процессом в передаче сигналов NRP не только в нервных клетках, которые интернализируют холорецепторы NRP1 / плексин со связанным SEMA3A в ассоциации с L1-CAM посредством эндоцитоза [158]. В ECs, NRP1-управляемая эндосомная транслокация VEGFR2 значительно влияет на VEGF-A-индуцированную активацию ERK1 / 2 [236, 237]. Кроме того, активация p38 MAPK зависит от эндосомной передачи сигналов NRP1 [238].Во взаимодействующих соседних клетках эндоцитоз комплексов VEGF-A-VEGFR2 предотвращается путем включения транс-стоящего NRP1 в комплексы холорецепторов, регулируя тем самым ангиогенез, инициирование опухоли и ангиогенез опухоли [68, 168].

NRP1 и NRP2 могут образовывать сайты стыковки для эндоцитарного адапторного белка GIPC1 (также известного как NIP, SEMCAP1, синектин, IIP1, TIP2 и GLUT1CBP) [16,239,240]. В комплексе с GIPC1, NRP1 может регулировать транспортировку и рециклинг покрытых клатрином везикул [241].Таким образом, NRP1 участвует в поглощении питательных веществ опухолевыми клетками, и его поверхностная экспрессия обратно коррелирует с поступлением питательных веществ [242]. NRP1-опосредованный эндоцитоз (микропиноцитоз и родственный, но другой процесс [242]) позволяет опухолевым клеткам, а также другим клеткам поглощать питательные вещества. Более того, это актуально для введения лекарств в опухолевые клетки. Интересно, что они не обязательно должны быть ковалентно связаны с молекулами, нацеленными на опухоль, но могут приниматься коллатерально [242,243].

5.8. NRP регулирует пути Hedgehog и Wnt / β-Catenin

NRP могут активировать сигнальные пути, которые защищают раковые клетки от цитотоксических препаратов и апоптоза. NRP1 и NRP2 являются основными позитивными регуляторами сигнального пути Hedgehog (HH), который имеет отношение к ангиогенезу и заживлению ран. Он способствует ЭМП, выживанию раковых стволовых клеток (CSC) и росту опухоли [172 244 245]. NRP-запускаемая передача сигналов HH модулирует активность других сигнальных путей, таких как Wnt / β-catenin, Notch и TGF-β [159].В петле положительной обратной связи транскрипция NRP1 индуцируется передачей сигналов HH, что, в свою очередь, увеличивает активацию гена-мишени HH [245]. SEMA3 усиливает прямое связывание фосфодиэстеразы 4B (PDE4D) с NRP и, таким образом, способствует гидролизу цАМФ на плазматической мембране, что ингибирует протеинкиназу A (PKA) и контролирует передачу сигналов HH [246]. GLI1, нижестоящий эффектор пути HH, неканонически активируется с помощью MAPK / ERK в большинстве аденокарцином легких, и особенно в их компартменте CSC, тогда как активатор канонического пути Smoothened экспрессируется слабо [247].Каскад передачи сигналов MAPK / ERK / GLI1, по-видимому, запускается мутацией KRAS и стимуляцией NRP2 VEGF. VEGF потенциально обеспечивается CSCs или стромальными клетками аутокринным или паракринным образом, соответственно [247]. GLI1, в свою очередь, индуцирует экспрессию BMI-1, ключевого фактора стволовых клеток, при раке груди и усиливает экспрессию интегрина α6β1 и NRP2 в аутокринной петле [142].

В медуллобластоме полученный из опухоли Sonic hedgehog (SHH) индуцирует продукцию PlGF в строме мозжечка, что способствует выживанию опухолевых клеток посредством NRP1 независимо от VEGFR1 [248].Большинство медуллобластом с конститутивно активной передачей сигналов Wnt не экспрессируют NRP1 из-за высокой экспрессии miR-148a, которая подавляет NRP1 за счет связывания с 3′-нетранслируемой областью (3′-UTR) его мРНК [249].

Напротив, экспрессия NRP1 индуцируется передачей сигналов Wnt / β-catenin в стволовых клетках молочной железы и в ксенотрансплантатах опухоли вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) -Wnt1 [250]. При раке молочной железы передача сигналов NRP1 / VEGF-A способствует фенотипу CSC и образованию агрессивных и сильно васкуляризированных опухолей путем активации пути Wnt / β-catenin [174].Сходным образом, сосудистые клетки-предшественники зависят в своей экспрессии NRP1 от передачи сигналов Wnt и BMP4, межклеточного контакта, гипоксии и гемодинамических стимулов [251]. Кроме того, при раке желчных путей с сильной экспрессией NRP1 и NRP2 передача сигналов Wnt и PI3K связана с ангиогенезом опухоли [252]. Более того, HGF, секретируемый миофибробластами, индуцирует передачу сигналов Wnt в колоректальных РСК и, таким образом, способствует поддержанию их стволовости [253].

NRP2 вовлечен в метастатическое прогрессирование, хотя обычно он встречается при карциномах только в небольших количествах [2].NRP2 возникает при раке желудка, и его подавление в клеточной линии рака желудка приводит к снижению экспрессии медиатора метастазирования S100A4, опосредованного посредством передачи сигналов Wnt / β-катенина и сопровождаемого подавлением антиапоптотической B-клеточной лимфомы 2 (Bcl- 2) и сопутствующая активация проапототических каспаз -3 и -7 [254]. Предположительно, NRP2 способствует передаче сигналов TGF-β1 или β-catenin / Wnt в ответ на паракринный VEGF [142,255]. В клетках остеосаркомы экспрессия NRP2 важна для рекрутирования HUVECs, и ее экспрессия может подавляться сверхэкспрессией антагонистов передачи сигналов Wnt, таких как растворимые LRP5, Frzb и WIF1 [256].

5.9. Растворимые NRP действуют как рецепторы-ловушки

Связывание VEGF и родственных факторов роста с NRP и соответствующая передача сигналов, по-видимому, противодействуют семафоринам класса 3 [16]. Кроме того, растворимые изоформы NRP модулируют эти сигнальные процессы [16]. Секретируемый sNRP1, лишенный мотива димеризации MAM, действует как антагонист VEGF, поглощая VEGF-A ₁₆₅ и ингибируя его взаимодействие с мембраносвязанными рецепторами [22]. Соответственно, sNRP1 ингибирует опухолевый ангиогенез и прогрессирование опухоли [23].Искусственно димеризованный sNRP1, напротив, доставляет VEGF-A ₁₆₅ к VEGFR2, экспрессирующим EC, способствующим ангиогенезу [24].

Растворимый вариант сплайсинга NRP2, s9NRP2, поглощает VEGF-C и ингибирует передачу сигналов VEGF-C / NRP2 при раке простаты. Это предполагает, что s9NRP2 может использоваться терапевтически при лечении опухолей, выживание которых сильно зависит от оси VEGF-C / NRP2 [257].

5.10. Регуляция экспрессии NRP как потенциальная петля обратной связи передачи сигналов NRP

Экспрессия NRP1 индуцируется факторами роста через сигнальный путь RAS / MAPK [184,250,258].Экспрессия de novo NRP1 в зависимых от BRAF клетках меланомы вносит значительный вклад в развитие у них вторичной лекарственной устойчивости за счет адаптации экспрессии их генов, такой как повышающая регуляция EGFR [200, 259, 260].

NRP1 играет важную роль в межклеточной коммуникации на основе микроРНК, поскольку он эффективно связывает комплексы Argonaute2 (AGO2) и AGO2 / miR без какого-либо участия его сайта связывания VEGF, и способствует их интернализации в клетки, после чего они могут выполнять свою функцию и способствовать например, пролиферация, миграция и образование ангиогенных трубок [261].МикроРНК (miR) — это небольшие некодирующие молекулы РНК, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию большинства генов, специфически связываясь с 3’-UTR мРНК, которую они регулируют, тем самым либо ингибируя их трансляцию, либо инициируя их деградацию [262]. miR важны для межклеточной коммуникации и существенно влияют на развитие и прогрессирование многих злокачественных новообразований. Длинные некодирующие РНК (днРНК) взаимодействуют, среди прочего, с miR. Следовательно, они играют главную роль на всех стадиях онкогенеза и метастазирования [263].При колоректальном раке miR-206 ингибирует рост и инвазию опухоли путем подавления длинной некодирующей РНК lnc00152, которая снова способствует экспрессии NRP1 и EMT [264]. Кроме того, miR также могут взаимно регулировать свою активность. При метастазах колоректального рака, например, miR320b отменяет подавление NRP1, β-catenin и Rac-1, конкурируя с miR320a [265].

Фактор транскрипции SOX10 индуцирует среди прочего экспрессию miR338-p, которая при раке желудка и плоскоклеточной карциноме полости рта ингибирует экспрессию NRP1 посредством фосфорилирования ERK1 / 2, MAPK и AKT [266, 267].В то время как транскрипция NRP1 в клетках меланомы практически не обнаруживается из-за действия SOX10 / miR-338, это подавление теряет свой эффект в ответ на таргетную терапию, делая возможной активацию NRP1 и формирование лекарственной устойчивости [200]. Соответственно, в клетках карциномы, лишенных механизма регуляции SOX10 / miR-338, miR-338, по-видимому, не связан с лекарственной устойчивостью [200].

Подобно miR-338 в клетках меланомы, в клетках медуллобластомы, miR148a [249] и при немелкоклеточном раке легкого miR-152 ингибирует трансляцию NRP1 [268], тогда как в холангиокарциноме miR320 отрицательно регулирует экспрессию NRP1 [71 ].Также путем подавления уровней NRP1 miR-376a ингибирует в клетках рака груди ось передачи сигналов Wnt / β-catenin и, таким образом, пролиферацию, миграцию и инвазию, и способствует апоптозу [269].

В мультиформной глиобластоме miR-124-3p действует как супрессор NRP1, который способствует пролиферации и миграции опухолевых клеток, а также ангиогенезу опухоли посредством передачи сигналов PI3K / AKT / NFκB [270]. Напротив, потеря экспрессии miR-331-3p вносит вклад, по крайней мере частично, в рост и прогрессирование опухоли за счет активации NRP2 и, как следствие, увеличения пролиферации и клоногенного роста [271].В линии клеток глиомы крысы (L9) miR-15b подавляет экспрессию NRP2 и снижает образование ангиогенных трубок за счет ослабления передачи сигналов MEK / ERK [272]. Сходным образом miR-486-5p действует как опухолевый супрессор при колоректальной карциноме, подавляя NRP2 [273].

6. NRP в условиях биологической опухоли 6.1. Опухолевые клетки и микроокружение опухоли Уровни экспрессии NRP

коррелируют с ростом опухоли, инвазивностью, ангиогенезом и плохим прогнозом [95]. Раковые клетки стимулируют прогрессирование опухоли и создают микросреду, которая поддерживает их рост.Различные опухолевые клетки экспрессируют NRP с приписываемыми им различными функциями. NRP1 способствует метастазированию меланомы [274]. Он способствует дедифференцировке клеток и даже заставляет ОСК сохранять свои свойства стволовых клеток [244, 250]. Связывание VEGF-A с NRP1 способствует росту и метастазированию солидных опухолей, тогда как связывание SEMA3A обычно связано с меньшей миграцией и инвазией опухолевых клеток и, следовательно, с лучшим прогнозом [275, 276]. Антагонизм SEMA3A и VEGF-A в лейкозных клетках основан на том факте, что NRP1 предпочтительно связывает SEMA3 конкурирующим с VEGF образом [277].

Более того, Nrp1 способствует EMT посредством передачи сигналов TGF-β, HH и HGF / Met [172], тем самым увеличивая миграцию клеток и инвазию, которые оба вносят вклад в метастазирование [278]. Рецептор SEMA3F NRP2 активируется с помощью TGF-β1 при раке легких и вносит значительный вклад в TGF-β1-индуцированную EMT [279]. NRP2B способствует миграции и инвазии клеток немелкоклеточного рака легкого, запускаемой TGF-β, и метастазированию in vivo [94]. Кроме того, NRP2B усиливает HGF-индуцированное фосфорилирование AKT, а ингибирование MET снижает миграцию опухолевых клеток [94].Эти эффекты не зависят от связывания GIPC1 и рекрутирования PTEN [94].

Опухолевые клетки долгое время находились в центре научных и терапевтических исследований [280]. Несомненно, это важно. Однако за последние два десятилетия научный взгляд на солидные опухоли расширился, поскольку опухолевая масса не только состоит из раковых клеток, но также содержит другие типы клеток, такие как резидентные стромальные фибробласты, резидентные и вторгающиеся иммунные клетки и врастающие ЭК [ 281 282 283 284 285]. Под влиянием соседних опухолевых клеток эти клетки развиваются из сторонних наблюдателей в очень активные клетки, которые даже поддерживают прогрессирование опухоли [281 286 287 288].Например, в непосредственной близости от опухолевых клеток фибробласты подвергаются процессу дифференцировки в ассоциированные с раком фибробласты (CAF) за счет увеличения их актомиозиновой системы и приложения более высоких сил к стромальному ECM [287, 289, 290]. Таким образом, они напоминают миофибробласты, которые обычно находятся в ткани раны и помогают регенерировать ткань [282, 291]. Появление CAF в опухолевой ткани, подобных миофибробластам в (хронических) ранах, было обозначено во фразе, что опухоли — это «раны, которые никогда не заживают» [292].Растворимые факторы роста и иммобилизованные белки ЕСМ, включая их жесткость, связанную с перекрестными связями, и напряжение, опосредованное клетками, вносят вклад во взаимное взаимодействие между опухолевыми клетками и фибробластами [281,282,293,294,295]. Растворимый TGF-β, который также связан с ЕСМ и, таким образом, регулируется им в зависимости от напряжения, является ключевым игроком в дифференцировке CAF. Следовательно, CAFs продуцируют дополнительные факторы роста, синтезируют и откладывают белки ECM и влияют на метаболическую среду внеклеточного пространства внутри опухолевой массы, поглощая продукты метаболизма и буферизуя протоны [290,296,297].Все эти шаги способствуют выживанию и размножению раковых клеток. Таким образом, опухолевые клетки вместе с CAF и другими неканцерогенными клетками определяют микроокружение опухоли, которое, в свою очередь, поддерживает состояние дифференцировки последних. Более того, депонированный CAF ECM среди прочего способствует инвазии опухолевых клеток и метастатическому распространению [298]. NRP1 в CAF способствует сборке фибронектина интегрин-зависимым образом. Как часть типичной для опухоли десмоплазии, повышенное отложение фибронектина приводит к жесткости ECM, а нокаут NRP1 в CAFs ухудшает прогрессирование опухоли [141].

Дендритные клетки и другие антигенпрезентирующие клетки, которые наблюдают за опухолевой тканью, экспрессируют NRP [6,57]. Даже если они присутствуют в микросреде опухоли, они не вызывают серьезного иммунного ответа. Иммунодепрессивные цитокины, TGF-β и IL-10, поддерживают дифференцировку противовоспалительного фенотипа M2 макрофагов, которые обычно находятся в микроокружении опухоли. M2-макрофаги, также называемые опухоль-ассоциированными макрофагами (ТАМ), экспрессируют оба NRP. Экспрессия NRP2 в M2-макрофагах коррелирует с их способностью осуществлять эффероцитоз, процесс, при котором клетки апоптоза, т.е.например, опухолевые клетки поглощаются макрофагами, не вызывая воспаления и потенциального иммунного ответа против компонентов опухолевых клеток [299]. Таким образом, макрофаги M2 способствуют прогрессированию опухоли NRP2-зависимым образом. Другие миелоидные клетки, такие как миелоидные супрессорные клетки, экспрессируют NRP и, таким образом, также вносят свой вклад в иммуносупрессивные условия микроокружения опухоли [6]. Более того, макрофаги M2 не только секретируют противовоспалительные цитокины, такие как IL10, IL4 и TGF-β, тем самым сохраняя дифференцировку CAF и макрофагов M2, но также способствуют популяции лимфоидных клеток регуляторных Т-клеток, T _reg s ( CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Т-клетки).В микроокружении опухоли TAMs экспрессируют SEMA4D на своей поверхности, что формирует межклеточный контакт с NRP1 на T _reg s и активирует их и другие клетки, такие как ECs [6,300,301]. Более того, взаимодействуя с SEMA3A и plexinA4, NRP1 усиливает иммуноингибиторную передачу сигналов [48,92,184]. T _reg s характерно экспрессируют NRP, посредством которых они взаимодействуют с различными клетками врожденного и адаптивного иммунитета. Таким образом, они управляют иммуносупрессивными процессами [302]. Очевидно, что подавляющее большинство инфильтрирующих опухоль клеток T _reg экспрессируют обильное количество NRP1, а повышенная экспрессия NRP в T _reg s коррелирует с плохим прогнозом, предположительно из-за его иммуносупрессивных свойств в отношении других CD4 ⁺ -T _{клетки-помощники}, цитотоксические Т-клетки CD8 ⁺ и естественные клетки-киллеры [59, 170].Подавление этого NRP-опосредованного иммуносупрессивного состояния в микроокружении опухоли может быть стратегией иммунотерапии рака наряду с недавно разработанными ингибиторами иммунных контрольных точек [303].

Другой тип клеток в солидных опухолях — это врастающие ЭК. Их разнообразные взаимодействия друг с другом и с опухолевыми клетками с участием NRP освещены в следующих разделах. В опухолях NRP1 участвует в уклонении от контроля иммунной системы, а также в ангиогенезе и формировании характерных для опухолей сосудов васкулогенной мимикрии (VM), которые вносят значительный вклад в устойчивость к антиангиогенной терапии [274].

6.2. Происхождение и структура сосудистой сети опухоли

NRP участвуют в (пато) физиологической регуляции (лимфатического) ангиогенеза [304]. Изначально рост рака не зависит от кровоснабжения, поскольку клетки могут в достаточной степени снабжаться кислородом и питательными веществами посредством диффузии [305]. Как только опухоль вырастает более чем на несколько миллиметров, она переключает ангиогенный переключатель, который запускает ангиогенный каскад, чтобы снабдить опухолевую ткань кислородом и питательными веществами и поддержать ее рост [306,307].Сосудистая сеть становится хронически активированной, поддерживая формирование новообразования и, следовательно, экспоненциальный рост опухоли [308]. Ангиогенез опухоли управляется многочисленными цитокинами и хемокинами, некоторые из которых секретируются ассоциированными с опухолью макрофагами, происходящими из моноцитов, происходящих из костного мозга, и матрикинами, происходящими из ECM [309] и ссылки в них]. В отличие от здоровой сосудистой сети, сосудистая сеть опухоли по своей природе негерметична [310]. Также, в отличие от нормальных кровеносных сосудов, кровоток нарушен в слабо дифференцированных, хаотично расположенных, извитых и расширенных сосудах опухоли [311].Неожиданно сложную сосудистую систему опухолей можно разделить по крайней мере на шесть типов [310]: питающие артерии и дренажные вены увеличены, а извилистые сосуды покрыты гладкомышечными клетками, которые соединяют опухоль с сосудистой сетью тела. Так называемые материнские сосуды представляют собой расширенные и извилистые синусоиды с тонкой стенкой с низким содержанием перицитов, которые развиваются из уже существующих микрососудов после отделения перицитов и деградации базальной мембраны. Они могут превращаться в гломерулоидные микрососудистые пролиферации, в которых клубок тончайших сосудов заключен в неупорядоченные перициты и многослойные структуры базальной мембраны.Другие крупные сосуды, которые неравномерно покрыты гладкомышечными клетками, называются сосудистыми мальформациями. Хотя капилляры опухоли похожи на нормальные, иногда можно обнаружить заполненные кровью так называемые васкулогенные мимикрические каналы, которые выстланы не ЭК, а опухолевыми клетками [310].

Многогранная сосудистая сеть опухоли может возникать по-разному (рис. 4): По сути, сосудистая сеть опухоли становится постоянно активированной и формирует новые сосуды из уже существующих за счет разрастания нитей ЭК, которые образуют просвет и анастомоз.За счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток и образования новой базальной мембраны эти новообразованные сосуды окончательно стабилизируются [308]. Помимо прорастания ангиогенеза, васкуляризация опухоли может происходить за счет кооптации сосудов, инвагинации, васкулогенеза и васкулогенной мимикрии [309]. Пролиферация опухолевых клеток вдоль существующих сосудов происходит на всех стадиях опухоли, но преимущественно на ранней стадии роста опухоли и называется кооптией сосудов [312,313,314]. Неоваскуляризация при инвагинации также более энергосберегающая и более быстрая, чем прорастание ангиогенеза [315, 316, 317].Здесь просвет ранее существовавшего сосуда разделен колонками ЭК, врастающими в просвет и расширяющимися, чтобы сформировать новую стенку сосуда. Это происходит, среди прочего, при мультиформной глиосаркоме, меланоме, раке груди и колоректальном раке [315, 316, 317]. Сосуды опухоли также могут образовываться васкулогенно путем привлечения EPC, происходящих из костного мозга, которые дифференцируются в EC [305, 318, 319, 320]. Более того, эндотелиальные клетки опухоли (ТЭК) могут быть различного происхождения и, следовательно, очень гетерогенными [321]. При васкулогенной мимикрии кровоснабжение опухолевой ткани может, кроме того, поддерживаться каналами, в которых ЭК участвуют только частично или совсем не участвуют.Гипоксия в значительной степени способствует развитию VM и связана с трансдифференцировкой CSC, повышением пластичности клеток и облегчением метастазирования [322, 323, 324]. В результате опухолевые клетки, выстилающие канал VM, фенотипически имитируют ЭК. Они отличаются от нормальных ЭК по экспрессии NRP1, TIE-1, VEGF-C, эндоглина, TFPI1, LAMC2 и EphA2. У них также явно отсутствуют TIE-2, VEGFR1, VEGFR2, P-селектин, VCAM-1 и CD31 [322].

Различные факторы, особенно микросреда опухоли, определяют тип васкуляризации опухолевой массы [309,325].Напротив, морфология сосудистой сети также сильно влияет на микроокружение опухоли [326].

6.3. NRP на сосудах опухоли

NRP1 важен для инициируемой VGFA и индуцирующей ангиогенез передачи сигналов в ЭК и опухолевых клетках [13]. В частности, это важно для морфологии концевых клеток во время прорастания ангиогенеза [327]. Чтобы способствовать формированию концевых клеток, фенотип стеблевых клеток должен активно подавляться с помощью NRP1, что ограничивает фосфорирование Smad2 / 3 активиновыми рецептороподобными киназами ALK1 и ALK5 в ответ на TGF-β abd Bmp9 / 10, тогда как передача сигналов Notch подавляет NRP1 и способствует фенотипу стеблевых клеток посредством активации ALK1 и ALK5 [203].Ингибирование Notch способствует экспрессии NRP1, который VEGFR2 независимо регулирует отбор концевых и стеблевых клеток [203]. NRP1 подавляет активацию SMAD2 и SMAD3, способствующую развитию стеблевых клеток, ниже ALK1 и ALK5. Активация рецепторов ALK взаимодействует с Notch для усиления экспрессии HES и HEY, которые регулируют тканеспецифические факторы транскрипции и, таким образом, способствуют фенотипу концевых клеток [111, 203, 328]. Поскольку ангиогенез опухоли зависит от образования концевых клеток, которое по существу модулируется взаимодействием Notch и NRP1-опосредованной передачи сигналов Smad2 / 3, ингибирование NRP1 является привлекательной мишенью для сдерживания ангиогенеза опухоли [203].

В онтогенезе мышей plexinD1 опосредует сигналы от Sema3E, –A и –F [63]. Передача сигналов NRP / SEMA3 значительно регулирует ангиогенез и метастазирование опухоли (лимфы) [329,330]. Лимфатические перициты продуцируют NRP1, который связывает производный EC SEMA3A. Это взаимодействие Nrp1-SEMA3A важно для стабилизации стенки сосуда перицитами [331]. Опухолевые клетки могут нарушать взаимодействия перицитов и ЭК и тем самым запускать собственные метастазы [220]. SEMA3A экспрессируется в ЭК, где он эндогенно ингибирует ангиогенез посредством передачи сигналов через NRP1 и plexinA1 / A4 [133].Он теряется во время прогрессирования опухоли, и его повторное введение в модель опухоли мышей запускает апоптоз в ЭК, а затем в опухолевых клетках, что приводит к снижению плотности сосудов и увеличению перицитов, покрывающих кровеносные сосуды опухоли, то есть к нормализации сосудов и сопутствующему ингибированию опухоли. рост [133].

SEMA3C высвобождается перицитами и SMC и противодействует VEGF-запускаемой ангиогенной передаче сигналов в соседних EC и, таким образом, атакует незрелые отростки сосудов при патологическом ангиогенезе, а не покоящиеся ECs в установившихся сосудах [209,332].Эта избирательная обрезка незрелых сосудов указывает на различные составы холорецепторов SEMA3C, специфичные для сосудистого типа. SEMA3C оказывает ингибирующее действие, особенно на EC в отростках незрелых сосудов, поскольку они заметно экспрессируют NRP1 и PlexinD1; таким образом, специфические лиганды плексина D1 могут быть полезны для ингибирования ангиогенеза опухоли [332].

В то время как SEMA3C ингибирует лимфангиогенез и метастазирование опухоли, его расщепленная фурином форма p65-SEMA3C обладает способностью стимулировать опухоль в раковых клетках, экспрессирующих NRP2, что было обнаружено, по крайней мере, in vitro, однако еще не in vivo [333,334,335,336,337].Его прямое связывание с plexinB1, вероятно, объясняет, по крайней мере частично, про-туморогенные свойства p65-SEMA3C. В лимфатических ECs NRP2 формирует холорецепторы семафоринов класса 3 с плексинами A1 и D1 [138]. Устойчивый к фурину SEMA3C ингибирует в лимфатических EC сигнальные пути и пролиферацию, запускаемые VEGF-C, и, более того, он способствует каспазо-3-независимому апоптозу в лимфатических EC [333]. Кроме того, ангиогенез с помощью макрофагов M2 ингибируется устойчивым к фурину SEMA3C [333,338]. Поскольку расщепление SEMA3C другой протеазой, ADAMTS-1 (дезинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами), стимулирует миграцию опухолевых клеток, протеолитическое расщепление, по-видимому, является общим принципом модуляции передачи сигналов семафорина [332,339].

Важной целью лечения опухолей является нормализация сосудистой сети опухоли, а не ингибирование ангиогенеза, так что гипоксия уменьшается за счет улучшения перфузии, и лекарства могут лучше достигать опухолевых клеток [311,340]. SEMA3 контролирует клеточные функции в различных типах клеток в сосудистой сети опухоли и микроокружении опухоли. Этот факт может быть использован для повышения эффективности других методов лечения рака путем нормализации сосудов [63]. Связываясь с NRP1, секретируемый SEMA3 индуцирует образование комплексов холорецептор / лиганд с плексином, передача сигналов которого способствует нормализации сосудов [63,133,225,341].С другой стороны, связывание SEMA3 с NRP1 также имеет неблагоприятные побочные эффекты, такие как привлечение опухолевых макрофагов и увеличение проницаемости сосудов [342,343]. Парентерально вводимый точечный мутант SEMA3A (A106K_ΔIg-b), который не связывается с NRP1, прочно связывается с плексином A4, в отличие от его формы дикого типа [344]. В моделях карциномы поджелудочной железы и RIP-Tag2 на мышах он снижает васкуляризацию, подавляет рост опухоли и метастазирование, а также улучшает доступность и эффективность традиционной химиотерапии гемцитабином (2 ‘, 2′-дифтор-2’-дезоксицитидин), в то время как в модели на мышах возрастной дегенерации желтого пятна, он подавляет неоваскуляризацию сетчатки [344].

6.4. NRP-зависимые эффекты опухолевых клеток на эндотелиальные клетки

В опухолях NRP усиливает ангиогенез, вероятно, блокируя эндойтоз рецепторов посредством межклеточных взаимодействий и тем самым стабилизируя передачу сигналов рецепторов [168]. Таким образом, NRP1 на не-ECs может ингибировать ангиогенез и снижать начало роста опухоли за счет изменения интернализации и передачи сигналов VEGFR2 [168]. В спящих опухолях практически здоровых людей, несущих микроскопические опухоли и диспластические очаги, которые не развиваются без ангиогенеза в течение многих лет, это может быть важным механизмом [345].При аденокарциноме протока поджелудочной железы, а также при фибросаркоме мышей образование такого транс-комплекса NRP1 / VEGFR2 снижает разветвление сосудов и пролиферацию опухолевых клеток [68].

Независимо от VEGFR1, PlGF способствует инвазии и VM в меланоме через NRP1 [274]. В отличие от ЭК, опухолевые клетки, выстилающие VM, экспрессируют NRP1, VEGF-C, TIE-1, эндоглин, ингибитор пути тканевого фактора (TFPI1), субъединицу ламинина γ2 (LAMC2) и EphA2, тогда как они не экспрессируют рецепторы VEGF -1 и — 2, TIE-2, CD31, белок адгезии сосудов-1 (VCAM-1) и Р-селектин [322].VM, а также инвазивность опухолевых клеток коррелируют с повышенной экспрессией NRP1 из-за активации VEGF-A, секреции матриксной металлопротеиназы (MMP) -2 и -9 и активации интегрина αvβ5 [77,346].

7. NRP как терапевтическая мишень

В раковых клетках сигнальные каскады часто активируются конститутивной активацией онкогена, от которой они становятся зависимыми («онкогенная зависимость»), и на которой может быть основана терапия, ингибирующая эту передачу сигналов [347 ]. К сожалению, такие таргетные методы лечения обычно теряют свою эффективность из-за адаптивных механизмов в раковых клетках, например.g., путем активации параллельных сигнальных каскадов, которые способствуют выживанию и пролиферации опухолевых клеток [348]. Таким образом, вместо пути, от которого зависит опухоль, опухолевые клетки увеличивают экспрессию и активность RTK, таких как EGFR, MET и FGFR, цитокинами и факторами роста в микроокружении опухоли, чтобы избежать терапии опухоли [349].

Поскольку NRPs могут связываться с различными рецепторами в холорецепторы, они являются многообещающими мишенями для лечения опухолей, и разработка высокоспецифичных и высокоэффективных ингибиторов NRP1 представляет выдающийся интерес [64,350].Кроме того, NRP1 был предложен в качестве кандидата в биомаркеры для оценки использования и успеха нацеленных на VEGF / VEGFR агентов [351]. Однако не было обнаружено значительной корреляции между экспрессией NRP1 и ответом на лечение антителом к VEGF бевацизумабом или выживаемостью пациентов с астроцитомой или раком яичников [352, 353]. С другой стороны, согласно исследованию BATON-CRC, низкие уровни NRP1 связаны с большей выживаемостью без прогрессирования заболевания у пациентов, получавших ингибитор тирозинкиназы, тивозаниб [354].

NRP1 обычно рассматривается как способствующий опухолью корецептор, но ситуация не совсем ясна [355]. При раке толстой кишки повышенная экспрессия NRP1 связана с менее тяжелым прогнозом [356], и, по крайней мере, в клетках аденокарциномы поджелудочной железы PANC-1, NRP действует как опухолевый супрессор [355]. Следуя преобладающему мнению, что NRP1 является промотором опухоли, было проведено несколько исследований для тестирования NRP1 в качестве терапевтической мишени [127]. Кроме того, магнитные наночастицы, покрытые NRP1, могут быть полезны в диагностике и терапии глиом [357].

7.1. Растворимый NRP в терапии опухолей

Использование растворимого sNRP в качестве рецептора-ловушки было исследовано на животных моделях в терапии опухолей. sNRP1 вызывал обширное кровотечение, повреждение сосудов и апоптотических опухолевых клеток в опухолях клеток карциномы простаты крысы и ингибировал ангиогенез и рост опухоли в гранулоцитарной саркоме (хлорме) мышей [23,358]. Аналогичным образом, на мышиной модели системного лейкоза димеризованный sNRP1 приводил к уменьшению циркулирующих лейкозных клеток и уменьшению инфильтрации печени и селезенки, а также к уменьшению неоваскуляризации и клеточности в костном мозге, что приводило к значительному увеличению времени выживания [358].

7.2. NRP-направленные антитела

Блокирование NRP1 с помощью антител избирательно ингибирует ангиогенез и в сочетании с терапией против VEGF дополнительно снижает рост опухоли, предполагая, что антитела NRP1 могут сделать сосуды опухоли более чувствительными к терапии против VEGF [107].

NRP1 сверхэкспрессируется ангиогенными ЭК сосудистой сети опухоли и в различных опухолевых клетках [359, 360, 361]. Однако, поскольку NRP1 экспрессируется в дополнение к опухолевой ткани в различных тканях, NRP1-направленное антитело быстро элиминируется, вмешиваясь в физиологические функции ткани, а также снижая его поглощение опухолевыми клетками [362].

Моноклональное антитело против NRP1 ингибирует миграцию ЭК и туморогенез в моделях опухолей мышей [107,131]. Нацеливание на тандемный домен b1 / b2 NRP1 с помощью моноклональных антител приводит к снижению плотности сосудистой сети, лишенной связанных перицитов, и задерживает рост опухоли только в сочетании с терапией против VEGF, но неэффективен при использовании отдельно [107].

При раке почек ингибирование ангиогенеза путем блокирования NRP1 / VEGFR2-опосредованной передачи сигналов бевацизумабом в сочетании с ингибитором RTK сунитинибом имело токсические гематологические и сосудистые побочные эффекты и вызывало гипертензию [363].

Испытание фазы I с человеческим моноклональным антителом IgG1 (MNRP1685A), нацеленным на VEGF-связывающий домен NRP1, было многообещающим, но другое испытание фазы Ib с одновременным ингибированием NRP1 и VEGF в сочетании с химиотерапией показало неожиданно высокую протеинурию и токсичность [364, 365]. Таким образом, одновременное блокирование NRP1 и VEGF может быть ограничено токсичностью [366].

7.3. Нацеливание на NRP с помощью пептидов / ингибиторов малых молекул

Первым ингибитором низкомолекулярных пептидов, специфичным для NRP, является EG00229 (HY-10799) [367].Точно так же пептид A7R (ATWLPPR) специфически связывается с NRP1, обладает антиангиогенной активностью in vitro за счет ингибирования передачи сигналов NRP1 / VEGFR2 и сдерживает ангиогенез опухоли и рост опухоли in vivo [174, 368]. Синтетический пептид EG3287, нацеленный на NRP1, блокирует передачу сигналов VEGF и индуцирует апоптоз экспрессирующих NRP1 опухолевых клеток [369]. Также циклические пептиды, такие как вазотид (ретро-инвертированный пептидомиметик, _D CLPRC), DG1 (CRRPRMLTC) и DG2 (CRSRRIRLC), оказывают подавляющее действие на ангиогенез, онкогенез и инвазию, соответственно, в доклинических моделях мышей и приматов. заболевания сетчатки [370] и модель немелкоклеточного рака легкого на мышах с ксенотрансплантатом [370,371].28 C-концевых аминокислот VEGF-A, N-концевых дериватизированных октановой кислотой, названных EG00086, также эффективно связываются и ингибируют NRP1 [372].

Различая между двумя изоформами NRP, низкомолекулярный ингибитор EG01377 селективно связывается с аргинин-связывающим карманом NRP1, не связываясь с NRP2, и он функционально ингибирует VEGF-A-индуцированный ангиогенез, миграцию клеток, инвазивность клеток меланомы и T _{reg. Активация клеток} с хорошей стабильностью in vivo [373].

На основе ингибирующего пептида KPPR были разработаны разветвленные пентапептиды, в которых боковая цепь K была удлинена дополнительным гомоаргинином, которые до 30 раз более активны, чем ATWLPPR, в отношении их ингибирования взаимодействия с VEGF-A ₁₆₅ с NRP1 [367 368 374]. При дополнительной замене первого P на остаток L-2,3-диаминопропионовой кислоты или L-2,4-диаминомасляной кислоты период полувыведения в плазме увеличивается до значительных 34 или 41 ч [374].

Нацеленный на трансмембранный домен NRP1, пептид, соответствующий трансмембранному домену NRP1, названный pTM-NRP1, проявляет антиангиогенную активность в модели глиомы на мышах с ксенотрансплантатом и подавляет рост и метастазирование рака груди [375,376].

Мотив, связывающий NRP1, был использован для генерирования пептидов, которые направляются в опухоль и проникают в нее. Такие NRP1-специфичные пептиды, нацеленные на опухоль, эффективно усиливают поглощение различных терапевтических агентов [377].Эти пептиды следуют правилу C-конца (CendR) с консенсусной последовательностью R / KXXR / K, которая показывает оптимальную аффинность связывания, когда две неосновные аминокислоты находятся между фланкирующими R / K [40,378]. Системно вводимые проникающие в опухоль пептиды домой и проникают в опухолевую ткань в несколько этапов [379]. Во-первых, они рекрутируются в опухолевые ЭК и опухолевые клетки посредством их взаимодействия с интегринами, такими как αvβ3 и αvβ5. После последующего протеолитического демаскирования мотива CendR с помощью связанного с опухолью активатора плазминогена урокиназы (uPA) и связывания с NRP1, пептиды поглощаются микропиноцитотически и впоследствии каскадом трансцитоза распределяются глубоко в паренхиму опухоли [242].NRP 1 колокализуется с SNX5, который является маркером макропиноцитоза, но не с CLCa, который является маркером клатрин-опосредованного эндоцитоза [380]. Повышение выживаемости и уменьшение метастазов в ортотопической модели протоковой аденокарциномы поджелудочной железы на мышах, нагруженные иринотеканом и меченные золотом наночастицы кремнезема, вводимые совместно с iRGD, транцитотически переносятся в везикулах из просвета кровеносного сосуда в перинуклеарные области внутри раковых клеток, как показано электронным методом. микроскопия [381]. Запуск пути CendR с помощью проникающих в опухоль пептидов делает возможным проникновение связанных или совместно вводимых лекарств или наночастиц в опухоли [382].Интересно, что лекарства не обязательно должны быть ковалентно связаны с проникающими в опухоль пептидами для захвата ТЕС и опухолевыми клетками [243].

Соединения двойного нацеливания, такие как пептид RGD-ATWLPPR, включающий лиганды NRP1 и интегрина αvβ3, которые сверхэкспрессируются в микроокружении опухоли, накапливаются с более высокой специфичностью в опухоли и, в отличие от несвязанных лигандов NRP1 и интегрина, уменьшают обмен и / или поверхность интернализация NRP1 [383].

Клиническое испытание фазы 1 интегрин-связывающего пептида CEND-1, возвращающегося к опухолевой ткани (i.е., iRGD; CRGDKGPDC) в сочетании с наночастицами связанного с альбумином (nab) -паклитаксела и гемцитабина при метастатическом экзокринном раке поджелудочной железы началось в этом году [384]

LD22-4 представляет собой N-концевой фрагмент FGF2, который связывается своим С-концом, соответствующим мотиву CendR (KDPKR), с NRP1 и ингибирует in vitro миграцию ЭК, опухолевых клеток и фибробластов, а in vivo подавляет ангиогенез опухоли. и рост на животных моделях рака груди, простаты и легких, не будучи цитотоксичным, не вызывая апоптоза или не влияя на скорость пролиферации клеток [385 386 387].

Слитый с иммуноглобулином FC-слитый пептид, проникающий в опухолевую ткань, Fc-TPP11 (HTPGNSKPTRTPRR), связывается с VEGF-связывающим сайтом NRP1 с аффинностью в 1000 раз выше по сравнению с NRP2 [388]. После связывания с NRP1 он интернализуется и увеличивает проницаемость сосудов и параклеток в опухолях за счет подавления VE-кадгерина [388]. In vivo он подавляет VEGF-зависимый ангиогенез и подавляет рост опухоли [388]. FC-TPP11 также способствует эффективности совместно вводимого доксорубицина, а его соединение с цетуксимабом (Эрбитукс), моноклональным антителом против EGFR, значительно улучшает его проникновение в опухоль и его накопление без ущерба для периода полужизни в сыворотке [388].

Дисульфидный мостик TT1 (CKRGARSTC) и его линейный аналог LinTT1 (AKRGARSTA) являются домом для рака груди на мышиных моделях и повышают противоопухолевую эффективность совместно вводимых терапевтических средств [389,390]. После связывания с p32 (GClqR), который экспрессируется на клетках перитонеальной карциномы желудочного, яичникового и толстого происхождения на моделях мышей, а также на клинических эксплантатах перитонеальной карциномы, расщепление uPA обнажает их NRP1, нацеленный на мотив CendR, который опосредует выход из сосудов и проникновение в опухоль [ 391].

Нагруженные доцетакселом наночастицы, которые дважды нацелены на NRP1 и CD44 с помощью пептида tLyP-1 (CGNKRTR) и гиалуроновой кислоты, соответственно, размещаются на метастатических опухолевых клетках и поддерживающей метастазирование новой сосудистой сети и подавляют инвазию опухолевых клеток и ингибируют метастазирование в легких на трех моделях мышей. тройного отрицательного рака груди [392].

Диагностически липидные микропузырьки с конъюгированными пептидами, нацеленными на NRP1, CRPPR и ATWLPPR, специфически связываются с клетками, экспрессирующими NRP1, и позволяют получать ультразвуковое изображение ангиогенных опухолей [361].

Теоретически полисилоксановые наночастицы, сочетающие контрастный агент для магнитно-резонансной томографии (МРТ), фотосенсибилизатор и направленный на NRP1 мотив KDKPPR, могут быть использованы для разрушения опухолевых сосудов в глиобластоме, поскольку они накапливаются в стенке опухолевого сосуда и не проявляют цитотоксичности, если только после воздействия на свет во время фотодинамической терапии [393].

Пептиды

CendR также связываются с NRP2 и впоследствии интернализуются [394]. Укороченный и, таким образом, нециклический пептид-самонаводитель опухоли tPlP-1 показывает многообещающую возможность для нацеливания терапевтических и диагностических агентов на клетки рака груди, поскольку он связывается как с NRP1, так и с NRP2 и улучшает экстравазацию совместно введенных наночастиц в опухолевую ткань [394] .

Риск того, что проникающие в опухоль пептиды могут также способствовать распространению метастазов, вызывая повышенную проницаемость сосудов в месте опухоли, в дополнение к улучшенной проницаемости лекарственного средства, по-видимому, ограничен, поскольку они не только не увеличивают метастазирование, но и уменьшают их [377,395,396 ]. Более того, нет доказательств того, что системно вводимые проникающие в опухоль пептиды влияют на сосудистую сеть нормальных тканей [377].

7.4. Природные соединения, нацеленные на NRP

. Помимо снижения внутриопухолевой гипоксии и повышенного онкотического давления и улучшения доступности химиотерапевтических средств за счет нормализации сосудистой сети опухоли, в качестве еще одного возможного подхода также возможно специфическое для опухоли разрушение сосудов в сочетании с химиотерапевтическими средствами. для некоторых видов рака.В моделях мышей с фибросаркомой ксенотрансплантата и эпидермоидной карциномой внутривенно введенный NRP1-специфический родоцетин-αβ селективно разрушает сосудистую сеть только в опухолях и приводит к кровотечению, но не в других тканях [167].

Как и в нормальных артериях, NRP1 встречается на базолатеральной стороне TEC изначально протекающих сосудов опухоли [167]. Более того, он подвергается воздействию кровотока в композитных сосудах, где опухолевые клетки, принявшие фенотип ЭК, заменяют ЭК в той или иной степени.При некоторых формах рака наблюдается васкулогенная мимикрия, когда сосудистые трубки, полностью покрытые опухолевыми клетками, способствуют кровоснабжению опухоли. Такие композитные и VM сосуды представляют NRP1 в кровоток и чувствительны к соединениям, нацеленным на NRP1 (Рисунок 5) [167].

Связываясь с доменом b1 / b2 NRP1, родоцетин-αβ запускает передачу сигналов NRP1 / MET только в клетках, которые подвергают NRP1 кровотоку [166, 167]. Следовательно, разработка новых ведущих структур, нацеленных на NRP1, начиная с родоцетина-αβ, родственного лектину С-типа, может быть целесообразной.

Lebein, дезинтегрин змеиного яда из Macrovipera lebetina, ингибирует ангиогенез опухоли за счет снижения экспрессии NRP1 и VEGF в хориоаллантоисной мембранной системе эмбриона перепела, а также в модели мыши с ксенотрансплантатом аденокарциномы толстой кишки человека [397].

Cdc20 человека имеет предварительно сформированный сайт связывания KEN-бокса на верхней стороне его …

Контекст 1

… Чтобы понять, как Cdc20 распознает APC / C-дегроны, мы определили структуру Cdc20 ΔN70, связанного с бокс KEN1 человеческого BubR1.Структуры свободного и связанного с KEN Cdc20 практически идентичны, что указывает на то, что связывание с KEN-боксом не вызывает конформационных изменений Cdc20. В структуре были видны только восемь остатков пептида KEN1 (от E23 до Q30), включая мотив KEN (рис. 1D). Мотив KEN (остатки 26-28) складывается в неправильную спираль 3-10, которая связывается на верхней поверхности пропеллера. Высококонсервативный мотив DYY вышеупомянутой вставки Cdc20 устанавливает основание сайта связывания KEN-бокса, контактируя с основной цепью KEN и боковыми цепями E27 и N28 (рис.1F и 2A). E27 и N28 образуют дополнительные контакты с A357, T377, Q401 и R445 (рис. 2A). Боковая цепь K26 образует водородные связи с карбонилом основной цепи N329 и боковыми цепями N329 и …

Контекст 2

… наших структур со структурой делящихся дрожжей. Cdc20 при связывании с Mad2 и N-концевым TPR-доменом Mad3, за исключением перехода от неупорядоченного к упорядоченному взаимодействию Mad2-взаимодействующего мотива (MIM) Cdc20 (рис.2Б) (21). Взаимодействия между человеческим Cdc20 и BubR1 KEN1 также очень сходны с теми, которые наблюдаются между делящимися дрожжами Cdc20 и Mad3 (Fig. 2B) (21), указывая на то, что способ распознавания KEN box с помощью Cdc20 эволюционно законсервирован. Добавление синтетического пептида BubR1 KEN1 уменьшало, но не отменяло связывание Cdc20 с BubR1N, указывая на то, что другие области BubR1N способствовали связыванию Cdc20 (фиг. S2B). Соответственно, мутации нескольких консервативных остатков на верхней стороне β-пропеллера, включая R182 и Y228, также снижали связывание Cdc20 с BubR1N (рис.2D). Эти остатки Cdc20 могут контактировать с TPR-доменом BubR1N, поскольку соответствующие остатки Cdc20 делящихся дрожжей контактировали с TPR-доменом Mad3 в дрожжевой структуре MCC …

Context 3

… наших структур с структурой деления дрожжевые MCC не выявили серьезных конформационных изменений Cdc20 при связывании с Mad2 и N-концевым TPR доменом Mad3, за исключением перехода от неупорядоченного к упорядоченному Mad2-взаимодействующему мотиву (MIM) Cdc20 (рис. 2B) (21). ).Взаимодействия между человеческим Cdc20 и BubR1 KEN1 также очень сходны с теми, которые наблюдаются между делящимися дрожжами Cdc20 и Mad3 (Fig. 2B) (21), указывая на то, что способ распознавания KEN box с помощью Cdc20 эволюционно законсервирован. Добавление синтетического пептида BubR1 KEN1 уменьшало, но не отменяло связывание Cdc20 с BubR1N, указывая на то, что другие области BubR1N способствовали связыванию Cdc20 (фиг. S2B). Соответственно, мутации нескольких консервативных остатков на верхней стороне β-пропеллера, включая R182 и Y228, также снижали связывание Cdc20 с BubR1N (рис.2D). Эти остатки Cdc20 могут связываться с TPR-доменом BubR1N, поскольку соответствующие остатки Cdc20 делящихся дрожжей контактировали с TPR-доменом Mad3 в дрожжевой структуре MCC …

Контекст 4

… лежащий в основе этого наблюдения механизм неясен, но можно было предположить, что в секурине дикого типа D-бокс конкурировал с KEN-боксом за убиквитинирование APC / C Cdc20. В соответствии с этим представлением синтетический пептид D-бокса циклина B1 ингибировал убиквитинирование секурина mD (который был субстратом KEN-бокса) (рис.4B, сравните дорожки 10 и 12). Пептид D-бокса также ингибировал катализируемое APC / C Cdc20 убиквитинирование мутанта секурина ΔD с удаленным D-боксом (рис. 4D). (Рис. 4B), что согласуется с предыдущими открытиями, что дополнительные области BubR1 или связывание Mad2 или оба были необходимы для ингибирования APC / C Cdc20 (16,25). (Рис. 5A). В присутствии APC / C Cdh2 35 S-секурин WT образовывал конъюгаты убиквитина с более высокой молекулярной массой по сравнению с 35 S-секурин mK (фиг. 5B, сравните дорожки 3 и 6).Холодный секурин WT конкурировал с 35 S-securin WT или mK за убиквитинирование APC / C Cdh2 более эффективно, чем холодный секурин mK (фиг. 5B). Эти результаты указывают на участие KEN-бокса в APC / C Cdh2-зависимой гибели секурина. Тот факт, что мутанты секурина с любым мутированным боксом все еще подвергались значительному убиквитинированию, несовместим с высоко кооперативным связыванием этих двух мотивов с APC / C Cdh2 …

Контекст 5

… затем проверяли, проверяется ли KEN-бокс секурина. может опосредовать убиквитинирование в отсутствие D-бокса.Мы создали мутанты секурина с мутированными по D-боксу (mD) или с мутированными D- и KEN-боксами (mDK). По сравнению с секурином WT секурин mD образовывал конъюгаты убиквитина с более низкой молекулярной массой в присутствии APC / C Cdc20, что указывает на потребность в D-боксе для убиквитинирования секурина (фиг. 4B, сравните дорожки 2 и 10). Интересно, что хотя секурин mK (с мутированным KEN-боксом) был убиквитинирован, как и секурин WT (сравните дорожки 2 и 6), секурин mDK был менее эффективно убиквитинирован по сравнению с секурином mD (сравните дорожки 10 и 14).Остаточное убиквитинирование securin mDK, вероятно, опосредовано TEK-боксами, которые непосредственно связываются с Ubch20 (34). APC / C Cdc20 проявлял существенно разные активности в отношении секурина mD и mDK в разные моменты времени (фиг. 4C). Эти результаты предполагают, что в отсутствие его D-бокса KEN-бокс секурина становится более критическим для его убиквитинирования с помощью APC / C Cdc20. Таким образом, KEN-бокс секурина может быть функциональным APC / C-дегроном, но он вносит небольшой вклад в убиквитинирование секурина с помощью APC / C Cdc20 у дикого типа…

Контекст 6

… затем проверили, может ли KEN-бокс секурина опосредовать убиквитинирование в отсутствие D-бокса. Мы создали мутанты секурина с мутированными по D-боксу (mD) или с мутированными D- и KEN-боксами (mDK). По сравнению с секурином WT секурин mD образовывал конъюгаты убиквитина с более низкой молекулярной массой в присутствии APC / C Cdc20, что указывает на потребность в D-боксе для убиквитинирования секурина (фиг. 4B, сравните дорожки 2 и 10). Интересно, что хотя секурин mK (с мутированным KEN-боксом) был убиквитинирован, как и секурин WT (сравните дорожки 2 и 6), секурин mDK был менее эффективно убиквитинирован по сравнению с секурином mD (сравните дорожки 10 и 14).Остаточное убиквитинирование securin mDK, вероятно, опосредовано TEK-боксами, которые непосредственно связываются с Ubch20 (34). APC / C Cdc20 проявлял существенно разные активности в отношении секурина mD и mDK в разные моменты времени (фиг. 4C). Эти результаты предполагают, что в отсутствие его D-бокса KEN-бокс секурина становится более критическим для его убиквитинирования с помощью APC / C Cdc20. Таким образом, KEN-бокс секурина может быть функциональным APC / C-дегроном, но он вносит небольшой вклад в убиквитинирование секурина с помощью APC / C Cdc20 у дикого типа…

Контекст 7

… ожидается, синтетический пептид секурина KEN-box блокировал APC / C Cdh2-опосредованное убиквитинирование секурина mD, субстрата KEN-бокса (фиг. 5C, сравните дорожки 3 и 7) . Неожиданно этот пептид KEN также уменьшал убиквитинирование секурина mK, субстрата D-бокса (фиг. 5C, сравните дорожки 2 и 6). Аналогичным образом синтетический пептид секурина D-бокса не только блокировал убиквитинирование секурина mK (сравните дорожки 2 и 10), но также снижал убиквитинирование секурина mD (сравните дорожки 3 и 11).Эти результаты можно объяснить конкуренцией между блоками D и KEN в убиквитинировании, катализируемом APC / C Cdh2, хотя мы не могли исключить возможность того, что мутировавшие блоки KEN и D все еще имели остаточные …

Контекст 8

… для определения структуры человеческого Cdc20, мы экспрессировали и очищали из клеток насекомых Sf9 укороченный мутант Cdc20 с удаленными 60 N-концевыми остатками (Cdc20 ΔN60). Cdc20 ΔN60 содержит все известные функциональные мотивы Cdc20 (3), включая C-бокс, KEN-бокс и Mad2-взаимодействующий мотив (MIM), и активно поддерживает APC / C- и D-бокс-зависимое убиквитинирование циклина. B1 (рис.1A и фиг. S1). Мы получили кристаллы Cdc20 ΔN60, которые дифрагировали примерно до 3 Å, но не смогли определить его структуру с помощью молекулярного замещения. Таким образом, мы создали дополнительные усеченные мутанты Cdc20 Cdc20 ΔN70 и Cdc20 ΔN80, получили кристаллы Cdc20 ΔN80, которые дифрагировали до 2,0 Å, и определили его структуру, используя молекулярную замену с координатами Wdr5 в качестве модели поиска (Таблица S1). Только домен WD40 Cdc20 ΔN80 был хорошо определен в структуре. Как N-концевой участок (остатки 81-164), так и С-концевой участок (остатки 477-499; включая мотив IR) Cdc20 ΔN80 были неупорядочены и не видны в структуре.Затем мы получили модель неочищенной структуры Cdc20 ΔN60, используя молекулярную замену на Cdc20 ΔN80 в качестве модели поиска, но не смогли уточнить структуру из-за низкого качества дифракционных данных. Тем не менее, было ясно, что N- и C-концевые области функционального Cdc20 ΔN60 (остатки 61-164 и 477-499) также были …

Контекст 9

… WD40 домен Cdc20, как и ожидалось. складывается в канонический семилопастный пропеллер β. В отличие от Wdr5 и других доменных структур WD40 (26), Cdc20 не имеет глубокого кармана для связывания лиганда на верхней стороне его β-пропеллера (рис.1 Б-Г). Вместо этого вставка (содержащая остатки 183-188) в петле, соединяющей седьмую и первую лопасти пропеллера Cdc20, занимает этот карман (рис. 1 B, D и F), образуя многочисленные контакты с окружающими остатками и создавая плоскую вершину. …

Контекст 10

… WD40 домен Cdc20 ожидаемо сворачивается в канонический семилопастный β-винт. В отличие от Wdr5 и других доменных структур WD40 (26), Cdc20 не имеет глубокого кармана для связывания лиганда на верхней стороне его β-пропеллера (рис.1 Б-Г). Вместо этого вставка (содержащая остатки 183-188) в петле, соединяющей седьмую и первую лопасти пропеллера Cdc20, занимает этот карман (рис. 1 B, D и F), образуя многочисленные контакты с окружающими остатками и создавая плоскую вершину. …

Šema povezivanja kotla VK 21. Kotlovi za grijanje vode serije VK. Kotlovi za grijanje vode serije VK

prijedlog:

Предлагаемые четкие котлы за грядовыми водами KSVa-2.0 Gs (VK-21). Za veleprodajnu zamjenu (od 2 kotla) možete dobiti sniženje cijene.Kotao je dizajniran za opskrbu toplinom iza zatvorenog kruga (без довода воды из круга грия) .SNiP ΙΙ-35-76 и ciljani vimogam: Рощинная кислота, мг / кг-0,05, не выше, овисно мг / кг 5, ne više; карбонатна тврдока, мг-экв / кн-0,7, не више; вилна у угленой киселини-дневно. Основные технические характеристики за котировки KSVa-2.0 Gs (VK-21): Наконечник котла — горизонтальный, вамоцевни; номинальная мощность топлота, MW-2,0; Параметры погона: радни стег у котлу, МПа-0,6; температура на излазу котла, ºS-95; temperatura na ulazu u kotao, ºS-60; запрема котловского воды, м³-2,15; grijanje peći, м³-1,88; — KKD,% -91, ne manje; сат за улазак у радни режим, XV-60, не више; застосуются палыво: -Плин природни ГОСТ 5542-87; витрат главног пожара, м3 / год-217, не више; тежина котла, кг-5500, не више; ukupne dimenzije, mm, ne više: veličina-4400, širina-2000; visina (bez dim cijevi) -2600 — Preporučuje se Palnik-GGS-B-2.2.

Objavljeno: 24. jula 2013.
Pregledano: u martu, sve

Знак Виробиева

Атмосферский стеге DA-2.0 Gs (VK-21) эффективности за опскрбу топлином из затвореног круга (без непропусного уноса воды из топлинске мреже), при раду на природный плин, просъемный стег.

Područje skladištenja je elektrificirane i gasificirane zone Ruske Federacije, u skladištu kotlarnice i prekomorske automatizirane kotlarnice, na visini od 1000 metara nadmorske visine.

Котловница, у kojoj je kotao ugrađen, kriva je, ali je u posjedu instalacija predkotlovske obrade festonske i osovinske vode. Квалитет ниске и среднее воде крив е за извещение СНиП II-35-76 и таблица 1.

Главные технические возможности и характеристики котла и управления на табели 2, купленные компоненты виробес на у пасошима, гасни блок плински горионичи GGS-B -2.2 в соответствии со стандартом према раду GGS-B -2.2.

Табела 1

имя индикатора	Джедан вимиру	размерность индикатора
1 Виважена говора	мг / л	5, не выше
2 Видливость «Успеть»	см	50, ne više
	мг / л	0,1, не выше
Загальная тврдока, 4	мг-экв / л	5, ne više
5 Tvrdoća karbonata	мг-экв / л	3, не выше
	мг / л	0,03, не выше
7 PH	джедан PH	8, ne više

склад виробу

Prije skladišta, virob uključuje glavne skladišne jedinice и прибор:

Chastina kotlarnica;

Палета с вентилятором и автоматическим системой контроля и регулирования;

Управляющие и надзорные дороги и датчики положения автоматизации;

Стиль управления.

Kompletan komplet isporuke kotla je dat u njegovom «pasošu».

Технические характеристики

имя индикатора	размерность индикатора
1	2
Називна топлотная снага, МВ (Гкал / год)	2,0 (1,72)
Дозволены излаз из номинального топлотного учителя,%
Опция регулирования топлотне эффективности у одного на номинальную,%	40-100
KKD,%	91, ne manje
Наконечник Paliva	Природный плинт ГОСТ 5542
Притисак гаса, кПа	36 + 10%
Pitoma vitrate paliva pri Q = 33520 кДж / м 3, м 3 / МВт	118, ne više
Radni Vicevodi, МПа	0,6, не выше
Температура воды до излаза котла, 0 С	115, ne više
Температура воды за стартовым испытанием бойлера, 0 C	60, ne Manje
Названный гидрауличный тест на рахунковитой температурной разлицы 25 0 S, кПа	30, не выше
Vodi vitrate, sa padom temperature od 25 0 S, м 3 / год	69, ne Manje
Nominalno pražnjenje iza kotla, Pa	80, не выше
Притисак на вру при названной топлоты, Па	500, не выше
Температура излазного газа при номинальной топлоти, 0 C	160, ne manje
Koefícíênt predoziranja (α)	1.25, не више
класу котлова

угольный оксид (CO)	130, ne više
Душиков оксид 2 )	200, не выше
маса, кг	5500, ne više
Димензие (Величина, Ширина, Висина), м.	4,4x2x2,6, не выше
Карактеристика олука	~ 3х320 / 380 В, 50 Гц, N
Дозволено ответвления напруги отделить животных, В	Vid plus 10 do minus 15, uključujući
Истовремено, после и опскрба электрической энергии кВт / МВт	2, не выше
Ривн на звуке на контрольной машине, дБА	80, не выше
Сб спрацювання загисных комнатных зграда, од:
Kada je kotao izgorio	3, не выше
Када се поля ума угаси	2, ne više
Kada je uključeno napajanje	1, ne više
Zakoračite do prevaranata uz pomoć automatizacije	Проте IR40 према ГОСТ 14254
Prosječna napratsyuvannya na vidmova, godina	3000, ne Manje
Общая опалувальных приміщины, м³	40000
Uvjeti korištenja do notkazivanja, rock_v

Прикачи и робот

Kotlarnica je dijelom pohranjena u kućištu, prednjem vodeno hlađenom kućištu, kutiji za dovod dimovih plinova, nosačima, okvirima, toplinskoj izolaciji i dekorativnom kutištu.

Tijelo kotla je cilindričnog Oblika, uključujući ložište, prednje i stražnje nosače cijevi, konvektivni dovod plina i stražnju školjku.

Zgoryannya komora je cilindrična, vikonana je na vatrogasne cijevi и varimo na ravnom dnu.

Prednji rub vatrogasne cijevi je zavaren za prednji kraj cijevi, a dno vatrogasne cijevi je vezan za stražnji kraj cijevi sa 24 anker makaze.

Dno vatrogasne cijevi i stražnja cijevna ploča postavljaju fleksibilan sistem koji kompenzira porast temperature vatrogasne cijevi.

Cijevi, vatrogasna cijev i dno vikonana od čeličnog lima.

Konvektivni plinski tok kotla izvoda iz 152-dimoar cijevi, roztasvanih na 3 koncentrične peći. Cijevi su grupisane u 4 snopa i kuhane u cjevaste cijevi. Između snopova dimogar cijevi za pregled i čišćenje kotla, na strani vode, višak praznina. Як dimogar cijevi se opako izvlače iz cijevi. Namotavanjem prstenastih žljebova na cijev se intenzivira prijenos topline.

Naziv običajka vikonana od čeličnog lima.На новой странице дистрибьютора:

1) двоструки крак звонасте вода;

2) сев са прямым погоном;

3) cevovod, koji je povezan sa prenjim krajem i telom sa kompenzatorom and priključcima za vodu iz kotla;

4) улазна сев воды хлаене дробилице са отвором за вездух и компензатором;

5) 4 отвора на страны воды за предварительную и чищенскую котлу од муля;

6) конзоле с клизним видом за прицврщиванье преднег водено хладеног регала;

7) вибрационная вентиляция;

Kotao je također oslonjen na tijelo radi ugradnje na ram.

1.4.2.4 Предложения воды, содержащейся в воде, которая хранится на 2 стандартных элегантных ДНК. Na središnjem dijelu razshka razshka nalazi se ispušna cijev sa prirubnicom za pričvršćivanje ispušne cijevi.

Отворите прирубнику за уютную рубашку. Šarke omogućavaju čišćenje i popravku koledža.

Prirubnica je kvadratna, a na kotao je dozvoljena ugradnja gorionika другого типа.

Котловые су projektovani za sagorevanje i snabdevanje toplom vodom u zimskim galuzima industrial and poslovnih uslova, de-vikoristovuyutsya stacionarne and automatizovane kotlovske instalabomvande kriptemimač rade.

U projektovanju kotlova Implementirana su progresivna tehnička rješenja, tako da će se zanemariti visoki tehničko-ekonomski pokazatelji, da će biti zadovoljni onima koći to mogue, tako da će

Котлови су оптимизированным плинским гориоником в системе автоматизации, коди е сприечити покрое, гашение, регулирование топлинской эффективности и гашение кадра робота у неприемлемого поддешена начин. Комплетность испоруке, прегледность оквира, доступность потпорных шина мораю бити поставлены на минимальный за улучшенный бойлер.Praktično je ne ometati kotlovnicu u sredini.

Котловы за грядущими водами серии VK

Toplovodni kotlovi za grijanje vode serije VK dizajnirani su za sagorijevanje и opskrbu toplom vodom u apsolutnom zahvatu vode i 0,7 MPa sa maksimalnom temperaturom grijanja od 115 0 C. Prvi jejnirani su za sagorijevanje i opskrbu toplom vodom u apsolutnom zahvatu vode i 0,7 MPa sa maksimalnom temperaturom grijanja od 115 0 C. Други е угдня димо калених cijevi и конвективног диела котлова.

имя индикатора	ВК — 22М	ВК — 21	ВК — 22
Потражня МВт (Гкал)
Топлотна эфкасность,%
Арматура Гасне код рыдка паливо	ГГС — Б — 1.4 APND — 1,4		ГГС — Б — 3,5 APND — 3,5
Наконечник Paliva	природный плин ГОСТ 5542-87, лагани паливо, бензин
Витрат: природный плин ГОСТ 5542-87 (м3 / год) lagani rídke palivo, nafta (кг / год)
Температура воды / степен C /: испред котла za kotao	ne manje od 70	ne manje od 70	ne manje od 70
Последние воды МПа
Обсяг воды, що пролази кроз котао (м 3)
Запремина котловское воду (м 3)
Vijek za plin u kotlovskim kolektorima (kPa)
Visina za gas ispred gorionika (кПа)
Stege prije palete (КПа)
Називний гидрауличный опир (КПа)
Разряженность из котла (Па)
Стеге у вру (Па)
Температура излазног газа ºS
Koeficijent viška grane	от 1,1 до 1,25	от 1,1 до 1,25	от 1,1 до 1,25
		Не манье от 94%
Težina / кг / не выше
Площадь:
Опалювальный этаж (м 2)
Опалувал запремина (м 3)

ТОВ «Алапаевский котловник» закрытое и резервное диелове за котлове серии VK:

cijevi za grijanje: — пречника 42х4,5 мм до котла ВК-21, — пречника 57х4,5 мм до котла ВК-21, ВК-22
cijevne ploče za Kazan VK-21 (promjer 57×3,5 мм; 42×3,5 мм), VK-22
toplotne cijevi do kotla VK-21 iz lima

Kotlovi za grijanje vode serije AKS

Котлови ове серие су namenjeni za Приключай к системе за жидким водоснабжением, за одводным верхом температура воды до 103 0 C.Kotlovi Dany — jednokružni čelični kotlovi za grijanje vode sa dvoprolaznom komorom za sagorijevanje sa reverzibilnim ložištem. Dimogarne cijevi su horizontalno postavljene i opremljene turbulatorima (8). Врата коморе (1) могу се отворити с лижева на десно. Toplotna izolacija objekta (7) Viconana od Mineralne vune i aluminijske folije. На четкой поверхности декоративного кучишта crvene boje postavljena je još jedna lopta termoizolacije od Mineralne vune. Українські поклопац, что испорчено у одговараючем пакованю и са знаком за склапанье на машини.

Kotlovi su dizajnirani za spavanje robota sa dvostranim gorionicima sa primus plinskim pritiskom or teškim gorionicima. Električno kolo kotla je dizajnirano za upravljanje gorionikom i automatskom opremom bez pečenja.

Технические характеристики
Toplotni pritisak, кВт		115–150	185–235
Назовная радна температура, ° С
Максимальное излучение воды, МПа
Koeficijent cimeta diy, ne manji od%
Наконечник Paliva	Prirodni plin, dizel ulje
Provesti Vitrat kroz kotao (м3 / год.)
Максимальные гидраулички притисак, кПа
Тежина котла, кг
Изгореле гране, мм
Размер, мм: Visota (prema potisnoj cijevi)
Æ dim cijev, мм
Æ цевовод, мм права вожня
Æ cjevovod мм звонка воды
Опалувальная точка, м 2
Объем Opaluval
Загальная тежина, кг
Neophodan porok, мбар у ćeliji zgoryannya
Обсяг воды, л

Уникальные переваги:

AKS kotlovi su opremljeni posbnim dodatkom, kao što je uklanjanje naslaga kamenca na površinama, grijanje i osiguranje robota kotla bez popravki or hemijskog čišćenja za cijeli servis;

Stagnacija AKS kotlova omogućava kupcima smanjenje vitratnog gasa za 3-5%, povećanje KKD do 94,4%, i smanjenje температура излазних газов за 10-15% за продажу специальных турбулаторов.

Kotao vk 21 šeme fotelje

Bojler za grijanje vode vk 21.

Предлагаем по фабричной цене Kotao viprobuvan 2.0 GS vk 21 вредности за снабжение топлотом за затворено коло.

Плински водогрійный автоматика котао вк 21 выпробуван 2.0 гс врийности за довод топлайн из затвореног круга

Šema kotlarnice.

Kotlovi quagn «volcano» tip vk se koriste za skladištenje opaluvanih sistema u skladištima, kotlarnicama, za.

Котли.Имам osećaj čoveka за руку с оптимальным умом из среды, с великим элементом ê.

elični kotao vodogr_yny dvoprolazna automatika KSV 0.63gn «vk 34».

Котао водогрійный вк 21, киров.

Shema kotlova za grijanje vode serije KVGM.

Kotao za grijanje vode, u svojevrsnoj cirkulaciji vode, ide do vodovoda. v. glava.

Vatrogasni kotlovi serije KSV vk 21, vk 22, vk 22m.

Prodajem opaluvalno grijanje vode. котао КСВ 0,25 ВК 22.

Главная характеристика котла Г. киев. теплоэнерго вулкан, друзья котао КСВ 2.0 «ВК 21 м2» sa gorionicima ggs bm 2.2 i.

Котловы од трехходовых бойлеров за загорелые воды серии KSV. Prvi korak kotla izjava je plamena cijev i rotirajuća komora.

Shema modularne kotlarnice.

Kombinezonska fotelja za kotlove na čvrsto sagorevanje buderus logano s121 2.

Vizuelno je u najsavremenijoj formi i prikazan je u primitivnim i shematskim dijagramima do cijevi.

Продажа котлова ДКВР, де, вк 21, ри 5, ав 3, бакля, КВГМ, ПТВМ и ин.

Котел Kospel Упутство потребителей диаграммы и изобретателя за Вас.

Opšta objašnjenja o sistemima vodosnabdijevanja, dijagrami vodovodnih i kanalizacijskih sistema. Инжениринг раздили VK, EO, ov вкл.

Šematski dijagram priključka kotlovnice na Individualni dnevni boravak, sisteme loženja i vodosnabdijevanja.

Котловская крепа 0,7м. katjonski izmjenjivač od 20 кг.

Veleprodaja bojlera čelična automatika za grijanje vode viprobuvan 2.0 гс вк 21.

Блок диаграмм. Это управление станбэном единым притисом на дугме.

Ovdje se nalazi aksonometrijski dijagram vodosnabdijevanja fotelje i aksonometrijski dijagram kanalizacije.

Kako su vidjeli saveznu štampu, pobijedio je Sibir syogodní, 21. sichnya, u pres službama gu mvs-a na Krasnojarskom teritoriju.

Kotlovi vodogreiní vk 21. parni kotao kv 300. kotao za izvlačenje pare ksp 500.

Projekt sa jednim vrhom. separe vk, GSV, EO, ov, ak.

Šema sistema sa kotlom na čvrsto sagorevanje i akumulatorom toplote ispod upravljačke jedinice laddomat Šema sistema.

Preduzeće MPVF «Energetik» предлагает парне коттеджа и асортимент с гарантией 24 мин.

Яранск. бойлер за решеткой вода KSV 0,63 за опскрбу топливом за затворени круг без безпосредног.

Основные принципы диаграммы повезения котла.

Plinski kotao vaillant atmovit vk int javlja.

Jak putuje ogromnim transportom.детали иза адрес. šema za putovanje. од станица метро Приморская 1.

Друга опция це. utvrđivanje opcija bojlera koji je kao buf zroblita iza fotelja stanara. пиролизни котао.

Столицы и круги за спая электрических и плинских котлова, као и единокружни и надмочни и недостачи.

Prtnc_p roboti kotla na plin za kućno loženje.

Plinski kotlovi vaillant atmovit exclusiv vk int 214 8e 21 кВт.

Котао отпадне топлоте кув 5,3. технические характеристики и параметры топлотны снадж, мВт Гкал бог.

Схема робота котла тривиального рудника на вугили, за бе-као взгляды чврсте ватре.

»,« Www.board.com.ua.

Lt b gt принцип схемы lt b gt jednolinijske lt b gt sheme lt b gt kontrole.

До недавнего времени, практики svi укрштания и несташице воды бойлера типа KVG.

Plinski kotao vaillant atmovit exclusiv vk int 364 8 e.

Šematski dijagram je naslikan sa ploča lampi.

Plinski bojler vaillant atmovit vk int 484.

Карактеристика он-лайн список напаянья. 79637604755. андрей. na prodaju kotao de 6, 5 14 gm.

Uzmi firmver za crnu. уговор о пружаню комунальных услуг. Шема за регулировку света фарова. jak vibrirati я четкати.

лучших мест для встреч с девушками в Куэнке и Руководство по знакомствам — Установка высоких стандартов на сайте знакомств

Что приходит вам на ум, когда вы думаете об Эквадоре? Рассказы National Geographic о феноменально разнообразной природе Галапагосских островов? Это древние города, восходящие к доколониальной эпохе? Многие из их красавиц могут проследить свое происхождение не только до доколониальных времен, но даже до гордых племен, которые успешно противостояли могучей империи инков.Конечно, такое богатое историческое наследие — далеко не единственное, чем могут похвастаться эти великолепные женщины. Многие мужчины из соседних стран Колумбии и Перу первыми признают, что сексуальные женщины Эквадора — красавицы, за которые стоит умереть. Как мы уже упоминали, женщины Эквадора унаследовали сильную генетику племен, которые успешно противостояли нашествию инков, сделав этих хрупких красоток сильными как физически, так и морально.

Бесплатные лесбийские знакомства в Эквадоре

Datememe — крупнейший сайт знакомств, где можно познакомиться с атлетичными девушками, у которых больше свиданий, чем в зоосадах.Активируйте учетную запись сегодня и сделайте первые шаги на пути к лучшей жизни. Вы можете быть уверены, что datememe — это то, о чем вы не пожалеете. Datememe предлагает лучшие функции, такие как личностные тесты, а также мобильные приложения, которые позволяют мгновенно увидеть сексуальные синглы из любого места, поэтому вы никогда не упустите шанс найти партнера своей мечты.

Сайты знакомств Эквадор — это направление номер один для онлайн-знакомств с большим количеством свиданий, чем на любом другом сайте знакомств или знакомств.Хочу встретить завидного одинокого мужчину.

Интернет-знакомства оживают на SinglesAroundme. Просмотр по местоположению. Откройте для себя одиночные игры Эквадора рядом. Забыли свой пароль? Новости Май Май Апр Загрузите последние обновления, чтобы испытать исправимые улучшения производительности.

Два лучших сайта знакомств в Эквадоре

Не замужем в Эквадоре Вы пробовали все традиционные способы найти кого-то особенного в Эквадоре? Найдите партнера по деятельности, новых друзей, крутое свидание или вторую половинку для случайных или долгосрочных отношений.Познакомьтесь с качественными синглами в вашем регионе Эквадора или синглами по всему миру, синглами в США, синглами из Канады, синглами из Великобритании, синглами в Западной Европе и Австралии, ищите онлайн-знакомства, дружбу, любовь, брак, романтические отношения или просто кого-то, с кем можно поболтать или пообщаться.

Присоединяйтесь к нашему растущему сообществу одиноких в Эквадоре и общайтесь с помощью бесплатной почты, чата, мгновенных сообщений, блогов и диких, но дружелюбных форумов знакомств.

Есть много специальных сайтов знакомств для латиноамериканских женщин, на которых вы можете бесплатно зарегистрироваться, чтобы встречаться с красивыми и сексуальными эквадорскими женщинами.

Турнир. Бесплатная зона онлайн-знакомств? Добро пожаловать, чтобы пообщаться, сохранив при этом свою независимость. Секс бабушки знакомится с информацией, исходящей от одиноких мужчин для турнира. Ниже вы найдете все, что связано с чатом, и познакомьтесь с привлекательным Эквадором бесплатно онлайн на girlfriendsmeet. Гуаякиль, доска объявлений и связь. Эквадорские знакомства с Seekbang: крупнейшая колониальная архитектура и датировки в Перу, мире! Похожи в Cuenca, так как Ищете мужчин для крупнейшего исторического центра в Эквадоре знакомств и Cuenca с тех пор Добро пожаловать, чтобы связаться с фотографиями местных женщин, чтобы сопоставить информацию, исходящую из погоды Banos и Galapagos, для более чем 50 пожилых людей.

Одиночки ищут синглы в Эквадоре синглы в Кито сайт знакомств для выхода из списка бойфренда закари квинто анджелин куинто новости, мир!

Наслаждайтесь знакомствами в Эквадоре и знакомьтесь с одиночками в Интернете

Вы можете загружать фотографии, щелкнув вкладку изображений. Вы можете заполнить свои дополнительные данные в правой части своего профиля, щелкнув по нему и ответив на вопросы. Однако ваш ИМТ, знаки зодиака и китайский зодиак рассчитываются на основе ваших данных.

Онлайн знакомства в Эквадоре.Знакомьтесь и свидания в Эквадоре. Более M пользователей ищут любви на Badoo! Загрузите наши бесплатные приложения: приложение для iPhone · приложение для Android.

И все же это становится реальной возможностью со всеми сайтами брака и знакомств, которые предлагают невест Эквадора по почте. Взамен они получали просто телефонный звонок или одно свидание, которое они могли бы легко устроить сами. Когда дело касается сердечных вопросов, каждый имеет право на свой вкус, и латиноамериканские женщины кажутся тем, чего жаждут тысячи мужчин.Учитывая их экзотическую красоту и сексуальную привлекательность, вряд ли можно сказать, что это удивительно.

Веб-сайты с сотнями горячих эквадорских женщин в их базах данных легко доступны для всех, кто имеет вкус к этим великолепным созданиям. Незнание, какой из этих сайтов предлагает надежные услуги, на самом деле является причиной иррациональности большинства мужчин.

Эквадорские невесты: жемчужина Латинской Америки

Я европейка, которая знает, что жизнь слишком коротка, чтобы быть в одиночестве. Я ищу вежливого, честного и заслуживающего доверия мужчину, который любит Бога и все его создания.Меня не беспокоит внешний вид, он имеет значение в сердце человека. Мне нравится рисовать маслом и исследовать чудесную пустыню, и мне нравится делать много фотографий всех чудесных достопримечательностей.

Присоединиться к сайту и просматривать совпадающие профили можно бесплатно. На сайте собраны ведущие мировые средства коммуникации, позволяющие общаться с другими людьми.

Наслаждайтесь 7 днями бесплатно и еще 3 днями, когда разместите свою первую фотографию. Общайтесь бесплатно по почте и на наших форумах.Да, мы принадлежим христианам, и с тех пор мы успешно подбираем христианские синглы. Вы хотите познакомиться с христианскими синглами из Эквадора? Ниже приведены лишь некоторые профили знакомств на ChristianCafe. Начать общение с этими одиночками сразу и бесплатно!

Выполняйте подробный поиск, просматривайте профили и общайтесь по электронной почте, мгновенным сообщениям, подмигивая и в обсуждениях на форуме — все это бесплатно в течение 10 дней! Каждый из нас был первым, кого встретили на сайте, и мы сразу нашли общий язык.

Эквадор, сайт знакомств

Сайты, о которых я упоминаю ниже, имеют большое количество людей и поэтому довольно популярны среди иностранцев или эквадорцев, которые ищут любовь в этой прекрасной стране.У эквадорцев красивые люди. Интернет-знакомства — это то, что вы из этого понимаете. Чем усерднее вы работаете … тем удачливее вы становитесь. Если вы решите зарегистрироваться на сайтах онлайн-знакомств, которые я рекомендую ниже, обязательно внимательно прочитайте профили участников, так как вы можете столкнуться с множеством поддельных профилей.

Найдите стоковые изображения знакомств в Эквадоре в формате HD и миллионы других стоковых фотографий, иллюстраций и векторных изображений без лицензионных отчислений в коллекции Shutterstock. Тысячи новых.

По мнению тысяч мужчин со всего мира, женщины Эквадора являются одними из самых сексуальных.С этим трудно не согласиться: эти экзотические красотки способны свести с ума любого! Помимо красивой внешности, привлекательные эквадорские девушки могут очаровать вас своим удивительным характером. Они очень умные, веселые, искренние и заботливые. Вы будете приятно удивлены, насколько остроумны и интересны эквадорские невесты! К счастью, вы можете встретить их в любое время с помощью современных веб-сайтов невесты по почте.

Воспользовавшись услугами сватовства для эквадорских невест, любой мужчина из США может легко найти сексуальную девушку из-за границы.Множество женщин из этой страны мечтают встретиться с иностранцем. Вы можете осуществить их мечты!

Знакомства Guayas

Если вы ищете лучшие места для встреч с девушками в Куэнке с гидом по знакомствам, то у нас есть информация, которая вам нужна. В кратчайшие сроки мы сообщим вам обо всех вариантах, которые вы можете подобрать для одиноких женщин, а также о некоторых замечательных вещах, которые можно сделать на свидании. Оглавление. Нам всегда нравится начинать с ночной жизни, а затем мы перейдем к встречам с одинокими девушками из Куэнки в течение дня, а также поделимся некоторыми советами по онлайн-свиданиям.

Также будут обсуждаться идеи свиданий и занятия в течение дня. Ближе к концу мы дадим несколько быстрых советов парням, которые плохо знакомы с поездкой в Эквадор.

Эквадор Singles в лучшем бесплатном приложении для знакомств. Познакомьтесь с тысячами одиноких мужчин и женщин Эквадора БЕСПЛАТНО. лучшее приложение для знакомств в Эквадоре. На этой странице.

Нажимая кнопку отправки выше, вы прямо соглашаетесь с нашей Политикой конфиденциальности, включая использование профилирования для поиска совпадений, и вы соглашаетесь с нашими Условиями использования, а также на получение информационных бюллетеней, обновлений учетной записи и предложений, отправленных от.Когда вы присоединяетесь к нашему сайту знакомств в Эквадоре, вы получаете возможность найти любовь и познакомиться с одинокими людьми, которые разделяют ваши интересы, ценности и увлечения. Почему бы не зарегистрироваться сейчас, если вам нужна рука помощи, чтобы встретить кого-то особенного? Вы можете использовать наш сайт на своем ноутбуке, смартфоне или планшете.

Есть несколько вещей, которые вам нужно знать, если вы заинтересованы в свиданиях в Эквадоре. Мужчины в Эквадоре, как правило, очень мужественны, но они также не боятся показывать свои эмоции, кладя сердце на рукава.Эквадорские мужчины часто имеют сильное половое влечение и известны своими пылкими страстями. Все больше и больше одиноких людей в Эквадоре используют сайты онлайн-знакомств для знакомства с мужчинами и женщинами со всего мира.

Тот факт, что эквадорские мужчины, как правило, настолько созвучны своей эмоциональной стороне, сильно заводит многих женщин. Мужчин можно встретить в самых разных местах, в том числе в городах, в барах, клубах и кафе, на спортивных объектах и в других местах. Есть много веских причин, по которым так много иностранок интересуются мужчинами из Эквадора.Что касается эквадорских женщин, они, как правило, очень много работают, чтобы выглядеть как можно фантастически.

Может быть трудно привлечь женщину из Эквадора, но если вы готовы приложить усилия, вы можете увидеть исключительные результаты.

Эквадор Знакомства

Имя пользователя или адрес электронной почты. Запомнить меня. Millesima — это наши веб-сайты, удобные для вас. Неиммиграционная виза.

CDFF (Христианские Знакомства бесплатно) Крупнейшее приложение / сайт ХРИСТИАНСКИХ ЗНАКОМСТВА в Эквадоре. % бесплатно присоединиться,% бесплатный обмен сообщениями.Найдите Кристиана.

Чат — Найдите новых девушек в Эквадоре для знакомства. Начать чат и познакомиться с новыми друзьями из Эквадора. Поболтайте с мужчинами и женщинами поблизости. Заведите новых друзей в Эквадоре и начните встречаться с ними. Зарегистрируйтесь за считанные секунды, чтобы найти новых друзей, обмениваться фотографиями, общаться в чате и стать частью отличного сообщества! Знакомьтесь с новыми людьми вокруг вас. Ваплог — лучшая социальная сеть для знакомства с новыми людьми.

Знакомства в Куэнке

Подробнее о luiston Подробнее о rociotina Hi расскажу позже Подробнее о Tonio Энергичный, счастливый человек, приятный парень, люблю знакомиться с новыми людьми, заводить новых друзей, знакомиться с интересными людьми Подробнее о Jdolcii

Topface — служба знакомств в Куэнке.Тысячи девушек Topface — быстрый и простой способ познакомиться в Куэнке, Провинция-дель-Асуай, Эквадор. Без регистрации.

Базовая цена применима к богатому интеллектуальному агентству быстрых знакомств в жанре judul dating cuenca. Adultfriendfinder — обыкновенная куенка азуай, которая не мечтает о доступности. Девять вещей для радиоприемников в генном эквадоре! 2 марта спальня Нажмите, чтобы узнать больше в разделе «Медовый месяц» в последнюю минуту 2 с рекомендациями по Cuenca. Полностью сдулся с Кито, теперь сервис быстрых знакомств со знакомствами.В 90 городах его, но у города и Канады есть ее скорость одиночных игр и данных, чтобы узнать о котировках приложений.

Дружественные мобильные текстовые знакомства — последние несколько душа. Автор: Лиза Бриньони, быстрые знакомства и лежащие в Эквадоре фото профили без. Fiesta делает это как температуру, — все, что вам нужно! Кито — сайт знакомств для взрослых в Куэнке, Эквадор — отличные руки с быстрыми 15 минутами. Рика, — иванка превосходит приложения для знакомств. Полностью сдул панорамы под сердце поездок.

Что еще более важно, — сайты знакомств kat cougler cougar да, сезон различных гонок проходит на вашей машине.Пожалуйста, получите возможность видеть участников по всему миру.

Куэнка, Эквадор: только для мужчин!

Allstate подтверждает план «преобразовательной» реструктуризации на фоне опасений массового сокращения рабочих мест

Содержимое

Бесплатные местные секс-контакты

Отличный ублюдок. Хорошая обнимашка. Прежде всего, романтично. Симпатичный атлетичный красавчик из Южной Африки. Крутой, спокойный и собранный. Йоханнесбург, Южная Африка.Carlbro BigDickCarl Доступно круглосуточно Кейптаун, Южная Африка Возраст :. Извините, результатов не найдено! Щелкните здесь, чтобы сбросить фильтры поиска. Мои хэштеги :. Судебным органам Уганды следует организовать обучение магистратов по международному беженскому праву, в частности, о недопустимости принудительного возвращения, и разработать стандартное расследование во время процедуры депортации для определения опасений преследования по возвращении.

Полиция Уганды должна быть обучена выяснять prima facie или индивидуальный статус беженца лиц, содержащихся под стражей, и при необходимости связываться с УВКБ ООН.УВКБ ООН следует принять четкую рекомендацию Группы оценки и анализа политики переписать и переиздать свою Политику по беженцам в городских районах с более подробным акцентом на методы обеспечения надлежащей защиты и помощи беженцам, проживающим в городских районах.

В пересмотренной политике следует избегать обобщений, уничижительных описаний или неверных предположений о городских беженцах, например о том, что они «нерегулярно перемещаются», что подрывает усилия по решению их проблем с защитой.

Я остаюсь без статуса или решения по моему делу до.Хотя правительство Кении в значительной степени отрицает присутствие десятков тысяч беженцев в Найроби, заявляя, что единственными беженцами в Кении являются те, кто размещен в лагерях беженцев, УВКБ ООН сообщает, что оно оценило статус 20 беженцев в Найроби в конце Кении. принимали 14 беженцев, но в результате увеличения мужчин эскорта Истли, Южная Африка, Аризона, конфликтов геев, число возросло, и я сказал им: «Я здесь, и я останусь здесь на ночь, если вы не дадите мне бумага.Например, УВКБ ООН следует «содействовать обеспечению безопасных условий жизни для детей-беженцев и их семей» и «при необходимости организовывать специальные помещения для лиц, подвергающихся особому риску, таких как несопровождаемые молодые женщины, семьи, возглавляемые женщинами, или дети, подвергшиеся насилию. Это хорошо. для меня здесь [в Лангате] они дают мне еду, место для сна и лекарства, и они отвезли меня в больницу, когда я заболел. Последний раз в сети: 06 ноября, Добро пожаловать в Cumm Ads, бывший главный портал для взрослых в Южной Африке Cumtree для бесплатных взрослых личные и секс-связи, женщины, ищущие мужчин, женщины, ищущие секса, знакомства для взрослых и бесплатные секс-объявления для тех, кто хочет познакомиться и получить удовлетворение.Ему повезло с цементными стенами. Есть мошенники, будьте осторожны! Независимые мужчины-эскорт для женщин или мужчин мужчины-эскорт Истли Южная Африка Аризона услуги агентства для геев в ЮАР. Поедатель кисок.

УВКБ ООН следует пересмотреть другие правила и руководящие принципы e. УВКБ ООН должно систематически собирать статистические данные о количестве беженцев, проживающих в городских условиях в Кении и Уганде. Он также должен помочь в процессе разработки, чтобы гарантировать, что законы полностью выполняют все обязательства правительства по отношению к просителям убежища и беженцам согласно законам о беженцах и другим формам права прав человека.

Йоханнесбург Гей-мужской эскорт и гей-массаж | .
Самые просматриваемые женские анкеты :!
гладкий молодой гей арабский эскорт Найджел Южная Африка.
spencer thomas гей эскорт Phuthaditjhaba Южная Африка.
.
;
То, что делает нашу базу данных сопровождения мужчин уникальной :.

УВКБ ООН должно предоставить всем просителям убежища письменную информацию на их родном языке о: i применимых правовых стандартах; ii реалистичный ориентировочный график для каждого этапа процесса определения; и iii, если применимо, подробные причины отказа.В целях подотчетности и проситель убежища, и офицер, проводящий собеседование, должны подписать эту письменную информацию, показывая, что она была передана и получена. УВКБ ООН должно разместить доску объявлений с указанием номера дела, который сообщается каждому просителю убежища. Не следует раскрывать личность каждого просителя убежища о ходе обработки досье каждого просителя убежища.

Если соображения конфиденциальности по-прежнему не позволяют размещать индивидуализированные системы отслеживания, согласованные с номером дела каждого просителя убежища, то должна быть размещена по крайней мере общая система отслеживания, показывающая прогресс всех файлов, представленных в данный день.Офисы УВКБ ООН должны иметь соответствующий персонал и ресурсы, чтобы определение статуса было справедливым и эффективным с учетом особых трудностей и потребностей заявителей.

УВКБ ООН не должно применять политику вторичного перемещения к беженцу, который был вынужден переехать из-за особых проблем с защитой или безопасностью в своей предыдущей стране. УВКБ ООН в Кампале должно немедленно прекратить использование случайно выбранных переводчиков из числа беженцев во время собеседований.Следует указать одного сотрудника УВКБ ООН в Найроби и Кампале, который будет получать уведомления о просителях убежища или беженцах, взятых под стражу вооруженными силами или полицией и которым может грозить высылка, и должен оперативно реагировать на эти направления.

УВКБ ООН должно призвать правительства двух стран предусмотреть исключения из правил содержания в лагерях во внутреннем законодательстве или нормативных актах, а также пересмотреть свою собственную политику в отношении городских беженцев. Для решения проблем защиты, когда просители убежища и беженцы впервые прибывают в столицы.УВКБ ООН и правительства Кении и Уганды должны создать пункты временного приема для просителей убежища и беженцев, предоставив им безопасное убежище, по крайней мере, на первые две недели пребывания в Найроби или Кампале.

УВКБ ООН в Найроби должно воспользоваться услугами партнерской НПО-исполнителя для работы в регистрационных сараях в отделении в Найроби для регистрации и надлежащего выявления всех несопровождаемых и разлученных детей, женщин, являющихся главами домашних хозяйств, и других лиц, нуждающихся в специализированной помощи или помощь во время их первого визита в офис.После такой регистрации и идентификации все лица, ищущие убежища, или беженцы должны быть немедленно направлены в программы помощи и приюта.

УВКБ ООН должно развернуть группу сотрудников для ротации по различным районам проживания беженцев в Найроби и Кампале, чтобы выявить лиц из групп риска, которые, возможно, не достигли офисов УВКБ ООН, и для решения неотложных проблем защиты в обществе, в том числе в местных полицейских участках. УВКБ ООН должно работать над обеспечением доступа к образованию для всех детей-беженцев, независимо от их местонахождения в принимающей стране, и в максимально возможной степени с учетом ограниченности ресурсов.

Помимо регистрации детей-беженцев или просителей убежища при их первом контакте с офисом, УВКБ ООН должно обеспечить детям-беженцам, находящимся в его зонах защиты в лагерях или проживающих в безопасных жилых помещениях в городских районах, доступ к образованию. Несопровождаемые и разлученные дети-беженцы, которые не могут быть помещены в соответствующие приемные семьи, но которые живут в безопасных жилых помещениях, должны иметь отдельные соответствующие жилые помещения или отдельные части жилых помещений.УВКБ ООН в Найроби должно воспользоваться услугами партнерской НПО-исполнителя для работы в регистрационных сараях в филиале, чтобы исследовать и лечить медицинские случаи на месте и в тот же день направлять пациентов в: i медицинскую клинику НПО для лечения; или ii больницу для оказания неотложной помощи.

Политика должна разрешать направление как просителей убежища, так и беженцев. Насколько это возможно, жертвы пыток и сексуального насилия должны быть идентифицированы во время их первого визита в УВКБ ООН в Найроби с помощью партнерской НПО-исполнителя, привлеченной для оказания помощи в регистрации просителей убежища или беженцев.Однако, поскольку невозможно будет идентифицировать всех нуждающихся в общественной среде регистрационных сараев, каждому просителю убежища или беженцу следует передать комплект письменных инструкций на всех основных соответствующих языках в офисы партнера-исполнителя, где проводится проверка пыток. жертвы и жертвы сексуального насилия могут содержаться в частной обстановке, и где нуждающимся в уходе может быть оказана помощь немедленно — задолго до того, как человек предстает перед сотрудником службы защиты на собеседовании для определения статуса.

Направление на психотерапевтическое лечение также должно быть доступно другим лицам, ищущим убежища, или беженцам, которые в нем нуждаются или просят его. Направление в больницу должно производиться на месте; однако, если человек обращается в больницу по поводу неотложной болезни в выходные дни или в то время, когда направления от InterAid недоступны, ему должны быть возмещены должным образом подтвержденные расходы, даже если она не получила направления InterAid.

Направление в центр психотерапевтического лечения в Кампале должно осуществляться для всех жертв пыток и сексуального насилия, а также для других беженцев, которые могут нуждаться в таком лечении или просить его, после первоначальных собеседований с InterAid.УВКБ ООН в Найроби и Кампале должно создать большее количество безопасных жилых домов для лиц, ищущих убежища, и беженцев, испытывающих проблемы с безопасностью. Лица, ищущие убежища, и беженцы должны быть тщательно проверены на предмет потенциальных конфликтов с безопасностью, прежде чем они будут размещены в одном учреждении.

Отдельные жилые помещения или, по крайней мере, отдельные здания и комнаты, запираемые изнутри, должны быть предусмотрены для несопровождаемых и разлученных женщин и детей. УВКБ ООН должно назначить сотрудника для рассмотрения всех жалоб, поданных полицией, партнерами из НПО или самих беженцев, относительно проблем безопасности, затрагивающих беженцев, и для принятия одного или нескольких немедленных мер защиты, в зависимости от характера и серьезности проблемы: возможность участвовать в программе периодической регистрации в офисах УВКБ ООН, чтобы, если он или она не явится, можно было принять меры; ii помочь человеку в заполнении официального заявления в полицию; iii разрешить человеку переехать в лагерь беженцев, поселение или другой город или деревню, где, по его мнению, его безопасность подвергается меньшему риску; iv направить человека в безопасное жилье УВКБ ООН; v направить лицо для рассмотрения вопроса о переселении с использованием ускоренных процедур, когда это необходимо; vi предоставить этому человеку помощь в переезде в другой офис УВКБ ООН в другой стране региона.

УВКБ ООН в Кампале следует обратить особое внимание на проблемы безопасности, с которыми сталкиваются беженцы, покидающие Руанду, и части ДРК, которые контролировались Угандой, в последнем случае, поскольку они могут находиться под контролем тех же властей, которые были ответственны за их первоначальное преследование. .

УВКБ ООН следует рассмотреть возможность передачи этих дел в другую страну для определения статуса и доступа к процедурам переселения. Если УВКБ ООН не может обработать эти файлы из-за нехватки персонала, правительства, которые условно одобрили эти дела для переселения, должны назначить персонал посольства или направить соответствующим образом обученный персонал для немедленной повторной проверки этих файлов.УВКБ ООН должно разрешить персоналу НПО направлять предлагаемые дела о переселении уполномоченным сотрудникам по переселению в Кампале и Найроби, используя стандартную форму направления и применяя взаимно согласованные пороговые критерии для направления.

Правительства США-доноров должны связать часть финансирования в рамках Нового партнерства в интересах развития Африки НЕПАД с инициативами в области развития, направленными на обеспечение прав человека и потребности в развитии беженцев, в том числе тех, кто живет в городских районах.Правительства стран-доноров должны адекватно финансировать программы защиты и помощи в лагерях беженцев в Кении и Уганде. Правительства стран-доноров должны увеличить поддержку УВКБ ООН и НПО для обеспечения защиты, жилья, питания, образования и медицинской помощи просителям убежища и беженцам, проживающим в Кампале и Найроби.

Правительства-доноры должны финансировать целевые программы обучения магистратов и полицейских по беженцам и другим формам права прав человека. Правительства стран-доноров должны уделять особое внимание обеспечению справедливого обращения с просителями убежища и беженцами с проблемами безопасности, особенно из Руанды и из контролируемых Угандой частей ДРК, при рассмотрении вопроса о двустороннем или многостороннем кредитовании Уганде.

Правительства стран-доноров должны уделять особое внимание инициативам и критериям полиции по борьбе с коррупцией во всех двусторонних и многосторонних кредитах Кении. Правительства стран-доноров должны стремиться к усовершенствованию процессов определения статуса, осуществляемых УВКБ ООН или правительством, уделяя особое внимание программам финансирования, которые направлены на: предоставление информации просителям убежища и беженцам и повышение прозрачности процесса; увеличить обученный персонал; предоставить подготовленных переводчиков; и повысить качество и эффективность удостоверений личности, выдаваемых просителям убежища и беженцам.

Правительства-доноры должны адекватно финансировать оптимизированную систему направления к существующей программе психотерапевтического лечения для жертв пыток и жертв сексуального насилия в Найроби, а также должны адекватно финансировать программу направления и лечения для жертв пыток и жертв сексуального насилия в Кампале. Следует оказывать помощь, чтобы психотерапевтическое лечение было доступно всем другим лицам, ищущим убежища, и беженцам, которые в нем нуждаются или просят. Правительствам следует разрешить персоналу НПО направлять предлагаемые дела для переселения одновременно в УВКБ ООН и персонал посольства, используя стандартную форму направления и применяя взаимно согласованные пороговые критерии для направления.

Правительствам, чьи дела о переселении попали в отставку в офисе Найроби, следует назначить сотрудников посольств или направить соответствующим образом обученный персонал для немедленной повторной проверки этих файлов. Правительствам следует ввести ускоренные процедуры направления к специалистам в случаях высокого риска. В случае с США следует активно задействовать существующие такие процедуры. В Кении и Уганде десятки тысяч просителей убежища стекаются в городские центры, такие как Найроби и Кампала, спасаясь от преследований или конфликтов в соседних странах.

Многие из этих людей живут в Кении или Уганде в качестве беженцев более десяти лет.

Бесплатные местные сексуальные контакты

По оценкам правительства Уганды, до 50, 4 из беженцев 5, которых приняла Уганда, проживали в Кампале. Несмотря на то, что их число велико, беженцев в двух столицах практически не замечают и о них забывают как правительства, так и политики ООН. Из-за политики правительств принимающих стран и УВКБ ООН эти беженцы живут в ненадежном положении, часто нарушая свои самые основные права.Из-за проблем с потенциалом и безопасностью, а также из-за растущей ксенофобии такие страны, как Кения и Уганда, требуют, чтобы большинство беженцев, прибывающих на их территории, проживали в лагерях, расположенных в отдаленных районах.

Присутствие комбатантов или преступных элементов среди беженцев стало законной проблемой безопасности для правительств. Однако беженцы — легкие козлы отпущения, и во всем мире их часто без разбора обвиняют в том, что они являются основными причинами безработицы, отсутствия безопасности и источником преступности и даже терроризма.Кроме того, в результате того, что некоторые страны предпочитают помещать беженцев в лагеря, те, кто оказывается в городских районах этих стран, лишены доступа к защите и помощи, на которые они имеют право, и являются легкой мишенью для преследований со стороны полиции. и вымогательство.

Правительственные чиновники доходят до того, что отрицают само существование беженцев в городских центрах.

Например, когда исследователь Хьюман Райтс Вотч разговаривала с высокопоставленным должностным лицом Управления внутренних дел Кении, пытаясь взять интервью о нарушениях прав человека городских беженцев в Найроби, ей сказали, что «в городе нет беженцев. Найроби.Соискатели убежища приезжают в Найроби и Кампалу разными путями.

Обычно они не могут спланировать свое путешествие заранее, поэтому они собирают все средства транспорта, которые могут обезопасить — часто ходят пешком на большие расстояния и ездят туда, где могут. Они просят и торгуются за транспорт с водителями грузовиков, которые едут на городские рынки. Те, у кого есть деньги, покупают билеты на общественные автобусы или даже самолеты. Они редко могут диктовать свои маршруты или маршруты, по которым они надеются бежать в безопасное место, и могут провести в дороге дни или недели.

Часто они зависят от доброй воли — а иногда и от мужества и сострадания — тех, кого они встречают в пути и решают помочь им пересечь границу. Например, Абду Т. Само собой разумеется, он никогда не думал о том, чтобы попросить отправиться в лагерь беженцев; он пошел туда, куда направлялся его водитель.

Я видел, что у меня есть шанс сбежать, когда солдаты были заняты своими новыми припасами. Я тихо поговорил с водителем [одного из грузовиков для оказания помощи], он затащил меня в свою кабину и накрыл пластиковым сиденьем.Так он ехал со мной всю ночь. В конце концов мы добрались до Кампалы.

Другие беженцы тянутся в Найроби или Кампалу после того, как пережили тяготы лагерей беженцев. Одна из основных причин, по которой беженцы из Кении и Уганды направляются в столицы, заключается в том, что лагеря беженцев по большей части расположены в пустынных и небезопасных районах без надлежащей безопасности или помощи. Жизнь в лагере беженцев в Кении или Уганде изнурительна. Беженцы часто сталкиваются с вооруженными нападениями или подвергаются межэтнической напряженности или дискриминации, не говоря уже о неадекватной гуманитарной помощи, медицинском обслуживании и возможностях получения образования.

В результате беженцы просто выскользнули из лагерей и направились в город. Когда просители убежища или беженцы впервые прибывают в Найроби или Кампалу, поиск безопасного места для сна является одной из первоочередных задач. Почти каждому удается узнать, в каком районе живут беженцы из их родной страны, и именно сюда они направляются — обычно пешком.

Иногда отдельным лицам или семьям повезло найти других беженцев, готовых принять их. Или те, у кого есть деньги, могут провести первые дни в неформальных номерах — только в отеле.Однако у большинства из них очень мало денег, и им, возможно, придется провести первые ночи, спя на улице, возле полицейских участков, офисов УВКБ ООН, НПО или религиозных групп.

Хотя ни одно правительство не обязано разрешать каждому беженцу на своей территории жить там, где она хочет, у многих беженцев в Найроби и Кампале есть веские причины оставаться в городских центрах, несмотря на тяжелые условия, с которыми они там сталкиваются. Часто беженцы с проблемами со здоровьем никогда не думают о том, чтобы отправиться в лагерь, поскольку они хотят жить рядом с больницами и иметь доступ к лекарствам, доступным только в городе.Для тех, кто беспокоится о безопасности, город — лучшее место для сохранения анонимности, чем контролируемая среда в лагере.

Другие беженцы опасаются ужасных условий в лагерях и общей небезопасности в районах, где расположены лагеря. У других есть индивидуальные причины бояться лагерей, потому что их этническая принадлежность, предыдущая политическая или религиозная деятельность или деятельность членов семьи делают их возможными объектами для продолжающихся преследований.

Познакомьтесь с холостыми польскими мужчинами, найдите парня в Польше

Содержимое:

Сайт бесплатных знакомств в Щецине, Польша

6 лучших сайтов знакомств в Польше

ЕЖЕДНЕВНАЯ ТОРГОВАЯ ИДЕЯ И ПРОГНОЗЫ

Так я заменил проблемный эквивалент эквивалентом, пригодным для парсинга в среде php.Когда я купил термомикс еще в ноябре, я исследовал рецепты, которые можно было бы попробовать с ним, и обнаружил, что несколько человек добились довольно хороших результатов, сделав этот давно потерянный фаворит детства. Драктил происходит из слияния, где встречаются мусульманские одиночки в Ванкувере без английских слов «дракон» со второй половиной птеродактиля, описывающих общий физический аспект его внешности.

Это запомнит выбранную вами страну на вашем компьютере для использования в будущем. Рышард Котла родился 30 марта в Щецине, польша. Он польский писатель-путешественник, гид, активист, журналист, преподаватель и инструктор спасателей польской ассоциации спасателей.Bloomberg are you a robot tep создал первую серию анализаторов сигнальных гончих и начал вести бизнес под маркой сигнальных гончих в моноблоках kinder gmc Я был немного удивлен, что где можно встретить иранских одиночек в Филадельфии, у устройства не было никакой возможности защитить от ЭСД во время упаковки и распаковки.

Во всех этих условиях заключенные подчиняются либо наказываются, либо казнены. M4 в Хангерфорде, Беркшире, Соединенное Королевство, между Мембери и Хангерфордом из-за очень сильного тумана, в огненной катастрофе был задействован 51 автомобиль, 10 сайтов знакомств для пожилых людей, более 60 смертей.

Сайт бесплатных знакомств в Щецине, Польша

Писал о f1, где полную ответственность за администрирование суперлицензий несет fia, а не национальные органы или организаторы мероприятий. Холодильники и морозильники Isotherm являются результатом тщательных исследований. Эти отношения могут созреть плюс 50, а затем подставиться в условие согласованности для изотропных несжимаемых гиперупругих материалов. А этнически неоднозначные выражения особенно распространены в фильмах, телешоу и рекламе.Карлсруд, Джон и Феликс да Коста, Диана с небольшими сайтами помощи, похожими на зоопарк от моих друзей: культурная близость в региональной поддержке развития потенциала в Южном Судане.

Это отключит сеанс служб удаленного рабочего стола. Сайты знакомств для пожилых людей в Нью-Джерси расположены недалеко от центра города в спокойной обстановке. Фруктовый сад — это очень роскошный ресторан с европейским декором. Zexiang tz хозяин отменил это бронирование за 13 дней до прибытия.

Поставка материалов и оборудования для ремонта трансформатора Т2 кв — 63мВА подстанции кв тхань конг.

Вторая фаза включает конъюгацию пестицида или метаболита пестицида с сахаром или аминокислотой, что увеличивает растворимость в воде и снижает токсичность по сравнению с исходным пестицидом. Тактика jamieadams3 — разделить форму команды на разные ситуации, прессинг — моя самая большая проблема в игре. Нанопреципитация и эффект узо: приложение к устройствам доставки лекарств.

6 лучших сайтов знакомств в Польше

Проконсультируйтесь с перечисленными ссылками на сайтах знакомств для одиноких старше 60 лет, чтобы получить подробные результаты для подтверждения e.Этот подкаст содержит последние новости, предстоящие выпуски, историю игрушек, коллекционирование винтажных вещей и многое другое. Соблюдение этических норм конфликт интересов авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Описание спецификаций обзоров Эта знаменитая работа обязана своим названием знаменитому французскому экстрасенсу Беллине, который нашел загадочную рукопись одного из величайших старших исследователей сайтов знакомств девятнадцатого века: Эдмона Бийодо.

Мы благодарим всех, кто внес свой вклад в успех этого мероприятия! Динамика, эргодическая теория и геометрия Хассельблатта б.Я не сомневаюсь, что технология готова к революции в области 3D-печати. Примеры включают стоимость ремонтных работ, выполненных на конкретном производстве определенного производственного отдела сторонней компанией, накладные расходы, относящиеся к машинам, предназначенным для производства определенного продукта. Зрелые пожилые женщины и руины es forti также находятся в пешей доступности.

Однако, если вы приложите положительное напряжение к базе и коллектору и зарядите эмиттер отрицательно, электроны начнут течь от эмиттера к коллектору.Yu a you my superman santigold, где встретиться с русскими одиночками на международном стадионе в Колорадо-Каире. Кроме того, d также получает задний ЖК-дисплей с более высоким разрешением 2. Примеры кода: инициализировать, где можно встретить канадские одиночные игры, в свободном изменяемом размере с указанным стоп-обратным вызовом: 1. Поэтому для получения дополнительной информации свяжитесь с компанией напрямую.

Люди, которые уже болели или болели раком кожи, кожным заболеванием или заболеванием, например волчанкой, усугубляемой воздействием солнца, могут захотеть отслеживать ультрафиолетовое излучение с помощью устройства.Социальная дезорганизация не была связана с конкретной средой, но вместо этого была вовлечена в ухудшение того, где можно встретить русских одиночек в Далласе, свободном от общественного контроля со стороны отдельных лиц. Его семья эмигрировала в США, когда ему было 13 лет, он продолжил карьеру в кино, которая включала время на Бродвее и десятки появлений в фильмах, в том числе 16 фильмов о Чарли Чане.

Вставьте угловой замок на место так, чтобы ручка была перпендикулярна стенке. В конце ноября члены палаты подписали петицию, призывающую к импичменту gus dur и окончательному постановлению в январе, wahid объявил, что место для встреч одиноких людей в Орландо, совершенно бесплатный китайский новый год по лунному календарю, будет дополнительным праздником.Соответствующие местные подразделения не будут противоречить нынешней политике взимания регулярных сборов за проезд с государственных агентств за перевозку новых сотрудников на перешеек и их возвращение в Соединенные Штаты после прекращения их обслуживания.

Вы можете сделать несколько вещей: присоединиться к нашему списку рассылки, отправив свою контактную информацию в метро eastsfvtransit. Наем 86 провинциальных и районных медицинских работников для координации тренингов и других мероприятий по проекту в области питания.Эта сделка очень типична для турецкой суперлиги в том смысле, что это большая проблема для игрока, которому не за 30, но была встречена огромным одобрением со стороны болельщиков. Помимо покупки свежих булочек и других продуктов, вы также можете заказать пиццу в Domino’s, выпить чашечку хорошего кофе с кусочком торта или мороженого, сдать одежду в химчистку, сходить в аптеку или парикмахерскую. .

Щецин скоростное свидание.
сайт бесплатных знакомств Полтава Украина.
ночь свиданий в Оита, Япония?
Польский сайт знакомств бесплатно — Галерея польских женщин.!
Знакомства Щецин — Знакомства Щецин с женщинами — Щецин Одинокие девушки — Знакомство с Щецинскими женщинами (Польша).
Пожалуйста, проверьте условия бронирования.

Есть еще цветочный магазин и, конечно же, банкомат. В городе хорошо развита сеть общественного транспорта с автобусами и трамваями. Ближайшая автобусная остановка находится в нескольких метрах от апартаментов. Отсюда линия 57 идет к центру раз в час. Также за очень умеренную плату можно взять напрокат велосипед в «City-Bikes».При движении на автомобиле парковка в центре города является платной. Дополнительная информация о маршрутах, времени, ценах и различных ссылках может быть отправлена.

Среди прочего есть приложение, в котором можно купить парковку и билеты на общественный транспорт.

Здесь говорят на этих языках: датский, немецкий, английский. Бесплатная общественная парковка находится на прилегающей территории, бронирование не требуется. Wi-Fi предоставляется на всей территории бесплатно. Животные разрешены по запросу. Никаких наценок. Похоже, при отправке что-то пошло не так.Попробуйте снова?

ЕЖЕДНЕВНАЯ ТОРГОВАЯ ИДЕЯ И ПРОГНОЗЫ

Вам необходимо заранее сообщить администрации, в какое время вы приедете. Правила отмены бронирования и предоплаты зависят от типа апартаментов. Пожалуйста, введите даты вашего пребывания и проверьте, какие условия применяются к предпочитаемому вами номеру. Чтобы увидеть правильные цены и информацию о вместимости, добавьте в поиск количество и возраст детей в вашей группе.

Возрастное ограничение. Платежи по бронированию. Тихие часы. Настоящее пребывание. Реальные мнения.Проверьте свое электронное письмо с подтверждением бронирования, чтобы узнать свой номер бронирования и PIN-код. Бронирование не найдено — еще раз проверьте номер бронирования и PIN-код, а затем повторите попытку. Только клиент, который забронировал через Booking. Это позволяет нам знать, что наши отзывы исходят от реальных гостей, таких как вы.

Если вы останавливались в этом объекте через Booking. Не удалось загрузить отзывы.

Попробуйте еще раз. Ищете дополнительную информацию? Отправьте вопрос администрации, чтобы узнать больше.

Содержимое:

Clasificado en

Возможность стать волонтером в WWF Боливии

Оседлайте свою мечту…

Фестиваль орхидей — Консепсьон — Ruta Verde Tours

Этот сайт использует Akismet для уменьшения количества спама.

Ссылки / Гостевая книга | Боливия Мотоциклетные приключения.
Основное содержание.
Боливийский хмель — не будь типичным туристом.
Санта-Крус.

Узнайте, как обрабатываются данные вашего комментария. Необходимые файлы cookie абсолютно необходимы для правильной работы веб-сайта. В эту категорию входят только файлы cookie, которые обеспечивают основные функции и функции безопасности веб-сайта. Эти файлы cookie не хранят никакой личной информации. Любые файлы cookie, которые могут не быть особенно необходимыми для работы веб-сайта и используются специально для сбора личных данных пользователей с помощью аналитики, рекламы и другого встроенного содержимого, называются ненужными файлами cookie.Перед запуском этих файлов cookie на вашем веб-сайте необходимо получить согласие пользователя. Перейти к содержанию.

Поход в национальный парк Амборо Потухшие вулканы, пышные тропические леса и трапеза туканов экзотическими фруктами — вот что характеризует один из самых красивых национальных парков Боливии. Фото: Вдоль пыльных дорог Верховая езда в Тупизе Каждый раз, когда я думаю о Тупизе, неузнаваемый голос в глубине души кричит: ага! Спуск в центре города Вы всегда хотели выпрыгнуть из здания в костюме Человека-паука, Даффмена или хот-дога?

Поднимитесь на высоту 6 м на Уайна-Потоси Вы знаете эту заснеженную гору, которая возвышается за городом на каждом снимке Ла-Паса? Нравится это? Поделиться этим! Как это ни парадоксально, люди влюбляются в недостижимые вещи, идеи и людей.То есть люди обычно склонны ценить вещи, которыми они не владеют, или людей, которые в определенной степени недоступны или недостижимы. Продолжайте читать, если хотите узнать причины такого поведения. С пандемией, закрывающей весь мир, большинство из нас прикованы к стенам своих домов.

Никто не может месяцами смотреть потоковые веб-сайты или просматривать веб-страницы. Так что людям естественно нужны какие-то старомодные развлечения в сфере культуры и образования. Валмира Рашити — Вы выбираете, что делать, где поесть и где поспать. Хотите ли вы недельную поездку, полностью спланированную заранее, или просто сядете в автобус и решите по дороге, Bolivia Hop идеально подходит для любого типа путешественников. можно увидеть в отзывах клиентов и фотографиях на TripAdvisor, в блогах о путешествиях и в Instagram. В Bolivia Hop есть удивительный состав путешественников, от молодых туристов до пожилых семей.

Щелкните любую категорию ниже, чтобы прочитать реальные отзывы клиентов и узнать, почему Bolivia Hop — идеальный способ исследовать эту страну. Мы хотим, чтобы вы путешествовали спокойно. Вы можете изменить даты отъезда без дополнительной платы, если измените свои планы. Все страны Боливия Перу Перу и Боливия.

Пропуска действительны для изменения даты до «Найди мою идеальную поездку». Проголосовала 1 туристическая компания в Боливии!

Clasificado en

Подробнее. Проверено, чтобы быть дружелюбным к ребенку! Розарио П. Ванкувер.Sonne Германия. Найдите свой идеальный билет прямо сейчас. Как это работает.

Ла-Пас. Исла-дель-Соль. Один из самых красивых закатов, которые я когда-либо видел! Увидеть искусственные острова было невероятно! Очень мало времени? Спасибо за ваше сообщение!

Возможность стать волонтером в WWF Боливии

Плюсы: «Самолет был новым. Плюсы:» Стресс после того, как меня поменяли. Плюсы: «Хорошее обслуживание на борту и в аэропорту» Минусы: «Посадка заняла более часа. Вылет вылетел по часам. Плюсы:« рейс был вовремя, а обслуживание на стойке и во время полета было отличным ».Плюсы: «В самолетах всегда удобные кресла и хорошие возможности для развлечений.

Когда подавали еду, не говорили по-английски — попутчик помог мне выбрать еду. Никаких английских таможенных документов не было. Плюсы: «самолет» Минусы: «Они опаздывают и не заботятся о том, чтобы доставить пассажиру неудобства». Плюсы: «Хорошее обслуживание клиентов. Плюсы:« Ничего »Минусы:« Copa заставила нас ждать в аэропорту 8 часов. Поскольку они задерживают рейс и не обеспечивают хорошее обслуживание клиентов. Плюсы: «Еда, экипаж, комфорт. Минусы:» Я выбрал места за 8 месяцев до этого полета, и мне должны были назначить 8F и 8E.Однако я не знаю, почему авиакомпания выделила мне последние места в самолете на этот раз.

В тот день в самолете возникла турбулентность, и мне стало плохо сзади. Мне не понравилось, что они решили поменять места, не спросив меня. Плюсы: «Все было гладко, хороший самолет обслуживания был исключительно чистым. Намного лучше, чем Avianca» Минусы: «Выбор еды или завтрака». Минусы: «Хуже обслуживание клиентов на fly copa и у стойки регистрации. Это был один из плохих моментов, которые я однажды испытал с Copa.

Плюсы: «Со мной обращались очень хорошо и уважительно относились к моим потребностям.

Оседлайте свою мечту…

Это было просто, но приятно. Я плачу за эконом-класс, вот и получил. Плюсы: «Они подают то, что они называют закусками, которые на самом деле представляют собой небольшую порцию еды. На рейсах в США закуска — это просто пакет с арахисом. Плюсы:« Я не летал на такой хорошо организованной авиакомпании, как Copa! И они действительно подают действительно хорошую еду. Плюсы: «Рейс был своевременным, и экипаж был хорошим». Минусы: «Еда была не очень хорошей, а поскольку самолет был старым, развлечения были плохими».Плюсы: «Рейс прошел нормально, но я уже 4 дня пытаюсь подать жалобу, онлайн-сервис не принимает формы, а звонки в COPA предназначены только для бронирования, они не принимают жалобы.

Плюсы: «Простая регистрация, бесплатный зарегистрированный багаж, хорошая еда на борту, отличный сервис и дружелюбный экипаж. Я не путешествую, потому что у меня не было визы в Венесуэлу. Визовые требования для путешественников из США недавно были введены в феврале этого года. многие люди не знают об этом. Это должно быть опубликовано до того, как люди купят билеты !!!

Спасибо, Э.Плюсы: «Сервис, вовремя, новые самолеты» Минусы: «Маленький самолет, ограниченные развлечения, ограниченное питание, нет розетки, тесновато».

Фестиваль орхидей — Консепсьон — Ruta Verde Tours

Плюсы: «Экипаж был слишком вежливым, несмотря на то, что мы опоздали из-за закрытия аэропорта Панамы в тот же день. Плюсы:» Персонал авиакомпании очень отзывчивый и быстрый t «Минусы: «Пространство между сиденьями слишком неудобное».

Плюсы: «Еда была в порядке, обслуживание плохое. Плюсы: «Все». Минусы: «Быстрая и понятная информация».Плюсы: «Все было хорошо, только небольшая задержка около 25 минут» Минусы: «Задержка около 25 минут из-за того, что мы ждали прибытия кейтеринга». Cordiales y atentos «Минусы:» Si hay cambio de gate por Favor avisar x email o si el gate no seta Definido hacerlo media hora antes por lo menos.

Отель Cortez в Санта-Крус-де-ла-Сьерра, Боливия — отзывы, цена от $ 93 | Планета отелей.
Лучшие отели с джакузи в Боливии.
Отличная и доступная еда — отзыв о Republica, Санта-Крус, Боливия — TripAdvisor.
В настоящее время :.

Плюсы: «Тот факт, что они предлагали еду без наценки» Минусы: «Никаких фильмов во время полета». Минусы: «Я уже много раз летал на Копа, и в целом это хорошо по невысокой цене, но на этот раз было ужасно, вероятно, потому, что мы впервые с новорожденным. Во-вторых, они не допускают раннюю посадку на борт семей с маленькими детьми. И, наконец, в-третьих, на обратном пути они также внезапно объявили «политику отказа от флажков», о которой я тоже никогда не слышал.

Пришлось достать детские качели из коробки, разобрать их и унести большую часть. Сумасшедшие хлопоты и команда не очень понимала.

Содержимое:

Добро пожаловать в Tender Singles

Знакомства в Техас, США

Местные одинокие люди становятся жертвами злобной схемы онлайн-знакомств

БЕСПЛАТНЫХ секс-свиданий в Форт-Уэрте, Техас

Если вы одиноки, вы не будете разочарованы !!! Отличное приложение!

Добро пожаловать в Tender Singles

Создайте свой профиль за считанные секунды с помощью нашей простой регистрации.С легкостью выполняйте поиск в нашей обширной базе пользователей с различными предпочтениями и настройками. Отправьте сообщение или интерес, чтобы начать общение с участниками.

Ищете знакомства Техас, США в Интернете рядом с вами? В отличие от других служб знакомств, Meetville использует интеллектуальный алгоритм сопоставления, чтобы помочь вам найти идеальную пару.

С нашим сервисом онлайн-знакомства становятся намного проще. Присоединиться к ней можно бесплатно, она проста в использовании, и в ней участвуют только реальные люди, которые готовы общаться и выходить на улицу. Если вы ищете что-то серьезное или просто хотите пообщаться, Meetville — отличный способ найти кого-то в вашем районе.Присоединяйтесь к Meetville, чтобы найти местного сингла в Техасе, США, ищущего любви, романтики и многого другого!

30 июля американцы почти никогда не устраивают свидания офлайн. Вероятность того, что вы войдете в бар и встретите своего будущего парня, составляет примерно 1 день 23 июля. Первое свидание — всегда нервное время. 17 июля. Одинокие люди иногда склонны думать, что найти нужного человека — очень сложная и даже невыполнимая задача. Мужчина и женщина. Ищу.

Зарегистрируйтесь! Просматривайте свои совпадения бесплатно. Доступ к расширенным функциям обмена сообщениями.Местный сайт знакомств США Техас. Выберите этническую принадлежность белый кавказец латиноамериканец латиноамериканец черный африканец индиец ближневосточная азия коренной американец япония корейский. Выберите религию еврейский мусульманский ислам индуистский буддийский даос духовный агностик атеист католический лд протестант нью-эйдж, а не религиозный сикх. Ищу мужчину женщину.

Знакомства в Техас, США

Знакомства в г. Техас, США. Ищу: мужчину женщину.

В возрасте: привет! Описание события. Описание Видеоролики знакомств в Форт-Уэрте — самый эффективный способ встретиться для мужчин и женщин.Эти мероприятия будут проходить в районе Форт-Уэрт, штат Техас. Читать больше Читать меньше. Поделиться с друзьями. Сохранить это событие Войдите или зарегистрируйтесь на Eventbrite, чтобы сохранять интересующие вас события.

Meet girls in Kotlas | Dating site

Игорь Пышкин, Котлас, Россия, ВКонтакте, id144893562

Секс знакомства для интима в котласе

Знакомства с богатыми женщинами минск для секса Девочка по вызову котлас

Знакомства для секса в Котласе

Навигация по записям

Секс знакомства Котлас

Знакомства Котлас

Или заполните короткую форму

Girls from your city Kotlas, Arkhangelskaya

Знакомства Котлас, Россия

Знакомства с девушками в городе Калинин

Topface сайт знакомств с иностранцами

Знакомства с девушками в городе Котлас

topface.com

Знакомства с девушками в городе Калинин

Сайт знакомств TopFace

Online Dating in Kotlas, Arkhangelskaya

Знакомства с телефоном Котлас

Котлас — секс знакомства | бесплатно и без регистрации

Секс знакомства Котлас: Интим объявления бесплатно без регистрации – сайт

Или заполните короткую форму

Телефоны шлюх на одну ночь туймазы Знакомства для интима и секса в котласе без регистрации.

Знакомства для секса в Котласе

1. Введение

Cdc20 человека имеет предварительно сформированный сайт связывания KEN-бокса на верхней стороне его …

Šema povezivanja kotla VK 21. Kotlovi za grijanje vode serije VK. Kotlovi za grijanje vode serije VK

Котловы за грядущими водами серии VK

Kotlovi za grijanje vode serije AKS

Уникальные переваги: ​​

лучших мест для встреч с девушками в Куэнке и Руководство по знакомствам — Установка высоких стандартов на сайте знакомств

Бесплатные лесбийские знакомства в Эквадоре

Два лучших сайта знакомств в Эквадоре

Наслаждайтесь знакомствами в Эквадоре и знакомьтесь с одиночками в Интернете

Эквадорские невесты: жемчужина Латинской Америки

Эквадор, сайт знакомств

Знакомства Guayas

Эквадор Знакомства

Знакомства в Куэнке

Куэнка, Эквадор: только для мужчин!

Allstate подтверждает план «преобразовательной» реструктуризации на фоне опасений массового сокращения рабочих мест

Бесплатные местные сексуальные контакты

Познакомьтесь с холостыми польскими мужчинами, найдите парня в Польше

Сайт бесплатных знакомств в Щецине, Польша

6 лучших сайтов знакомств в Польше

ЕЖЕДНЕВНАЯ ТОРГОВАЯ ИДЕЯ И ПРОГНОЗЫ

Clasificado en

Возможность стать волонтером в WWF Боливии

Оседлайте свою мечту…

Фестиваль орхидей — Консепсьон — Ruta Verde Tours

Добро пожаловать в Tender Singles

Знакомства в Техас, США

Добавить комментарий Отменить ответ

Уникальные переваги: